Всего Гора иммунного обонятельных рецепторов нейронов в Дрозофилы Антенны

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации нейронов обонятельных рецепторов с помощью окрашивания антенн всего монтирования. Сначала обезболите муху, чтобы разрезать ее голову вертикально. Далее положите рассеченную голову мухи на яблочную тарелку.

Затем отрежьте третий сегмент антенны и поместите его на стеклянное дно чашки для культивирования с целью проведения иммуногистохимии. После установки антенн в предметное стекло мы можем визуализировать различные типы нейронов обонятельных рецепторов с помощью конфокального микроскопического hi. Мы работаем по обонятельной системе.

Обонятельная система используется для различения множества других молекул. Широкий спектр различных обонятельных нейронов, которые существуют в этой системе, обеспечивает точную и скоординированную передачу информации от рецепторов-мишеней к нейронам в мозге. Сегодня мы опишем окрашивание всей антенны, чтобы обнаружить диверсификацию этих нейронов обонятельных рецепторов.

Для того, чтобы обеспечить успешное окрашивание всего крепления и антенны, крайне важно подготовить новую партию фиксатора непосредственно перед началом протокола. Обезболите муху, а затем разрежьте голову мухи вертикально, удерживая ее тело щипцами. Теперь аккуратно поместите рассеченную антенну на яблочную тарелку.

Вырежьте третий сегмент антенны с помощью ножниц для тонкого препарирования. Поместите 90 микролитров фиксирующего раствора в центр посуды. С помощью острой иглы аккуратно перенесите рассеченную антенну непосредственно на Фиксирующий раствор.

Теперь дайте фиксации беспрепятственно продолжаться в течение 40 минут при комнатной температуре, чтобы завершить фиксацию. Промойте усики трижды PBST в течение 10 минут за промывку во время удаления моющего раствора. Сначала поднесите все усики к центру посуды с помощью иглы.

Затем уберите раствор с бортика посуды. Перемешивание во время инкубации не требуется. Чтобы подготовиться к окрашиванию, удалите последний смыв PBST и заблокируйте неподвижные усики, заполнив камеру 90 микролитрами 5%-ной лошадиной сыворотки в 0,1%-ном PBST. Замените блокирующий раствор первичными антителами, разведенными в смеси 5%-ной лошадиной сыворотки.

В PBST основными антителами являются мышиный анти-GFP один к 400 и крысиный анти-eof, разбавленные до концентрации 1 к 200 для предотвращения высыхания образцов антенн. Поместите влажную салфетку в крышку чашки для культуры и оберните ее параформой. Затем поместите чашку для культуры в пластиковый контейнер, содержащий влажные салфетки.

Инкубируйте усики в первичных антителах в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия через 48 часов. Очистите несвязанные первичные антитела шестью промывками в PBST в течение 10 минут за промывку. Аналогична ранее описанной процедуре фиксативного удаления.

После часа промываний PBST добавьте вторичный раствор антител, разведенный в смеси 5% лошадиной сыворотки В этом примере антителами являются SI two anti rabbit IgG и SI three anti rat IgG. Накройте емкость алюминиевой фольгой от этого места вперед, чтобы предотвратить фторочетверку. Затем проводится фотообесцвечивание: инкубация антенны во вторичном антителе в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия.

На этом этапе антенна готова к монтажу для установки антенны. Удалите как можно больше PBST из чашки для культивирования и постепенно начинайте вводить глицерин в усики. Затем добавьте в блюдо 40% глицерина на одну-две минуты, затем выньте его, добавьте 80% глицерина и оставьте на пять минут.

Флуоресцентное окрашивание выявило Elof-положительные нейроны и целевые обонятельные нейроны. Комбинируя эту процедуру с другими подобными методами, включая генерацию генетической мозаики обонятельных нейронов, мы надеемся инициировать механическую дедиверсификацию обонятельных нейронов и ответить на другие важные научные вопросы.