Оценка фагоцитарной оформление гибель клеток в экспериментальной инсульта на Ligatable флуоресцентных зондов

Общая цель данной процедуры заключается в селективном мечении активных фагоцитарных клеток, которые удаляют остатки погибших клеток при инсульте. Это достигается путем предварительной подготовки компонентов для реакции усиления сигнала на основе Tite, после чего следует этап подготовки срезов.

Затем проводят реакцию мечения с использованием фермента вакцинии, топоизомеразы и лабильных флуоресцентных зондов. Заключительным этапом является усиление флуоресцентного сигнала на основе IDE. В итоге используется флуоресцентная микроскопия для оценки фагоцитарного клиренса погибших клеток в срезах тканей при очаговой ишемии головного мозга.

Утилизация погибших клеток фагоцитами играет важную роль в восстановлении мозга после ишемии. Представленный метод позволяет определить эффективность этого процесса путем маркировки только тех фагоцитов, которые активно удаляют погибшие клетки. Хотя данный метод дает представление о состоянии ишемизированного мозга, его также можно использовать для изучения ишемического повреждения других органов и тканей.

В тех случаях, когда важна кислая очистка от мертвых клеток с помощью FA. Хотя этап усиления сигнала IDE или TSA происходит на финальной стадии маркировки, подготовка к этой реакции может занять более часа. Поэтому удобнее сначала приготовить реагенты для TSA.

На первом этапе необходимо приготовить основной раствор fluoro four TYROM, добавив 300 µL DMSO к реагентам tyrom, входящим в набор для маркировки TSA. Затем приготовьте промывочный буфер TNT, чтобы полностью растворить блокирующий реагент. При приготовлении блокирующего буфера TNB медленно добавляйте его небольшими порциями при перемешивании, постепенно нагревая раствор до 55 °C.

При непрерывном перемешивании раствор приобретет молочный вид; перед использованием аликвоты его следует довести до комнатной температуры, а для длительного хранения в рамках данной процедуры поместить при температуре -20 °C. Слайды подготавливают заранее, монтируя срезы толщиной 5 µm, полученные из фиксированной формалином ткани. Сначала обработайте срезы ксилолом в течение 15 минут, затем проведите регидратацию срезов через серию промывок этанолом с последующими двумя промывками в воде.

Затем приготовьте рабочий раствор протеиназы K, разбавив стоковый раствор в PBS до концентрации 50 µg/mL. Самым сложным этапом данного эксперимента является определение оптимальной продолжительности воздействия протеиназы K; в зависимости от размера и типа ткани может потребоваться подбор контрольных образцов с более коротким или более длительным временем переваривания для обеспечения успешного результата. Добавьте соответствующий объем рабочего раствора протеиназы K к срезам и инкубируйте в течение 15 минут при 23 °C.

После инкубации промойте срезы в дистиллированной воде дважды по пять минут. Пока срезы вымачиваются, приготовьте маркирующую смесь, содержащую активный зонд. Для приготовления раствора активного зонда объедините олигонуклеотиды с водой, одним молярным раствором Трис-HCl и вакцинированной топоизомеразой, входящей в состав набора; аккуратно перемешайте содержимое путем пипетирования и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут для активации зонда.

После второго этапа промывки извлеките срезы из флакона и аспирируйте остатки воды. После этого нанесите подготовленный ранее активный раствор зонда, чтобы полностью покрыть срезы. Оставьте срезы инкубировать в течение 15 минут при температуре 23 °C.

После инкубации погрузите предметные стекла в воду, чтобы аккуратно снять покровные стекла. Промойте предметные стекла в воде трижды по пять минут. После последнего промывания нанесите на срезы ткани блокирующий буфер TNB и инкубируйте стекла во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре.

В течение этого времени приготовьте разведение 1:100 конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (S-A-H-R-P) в блокирующем буфере TNB. Достаньте предметные стекла и аспирируйте блокирующий буфер TNB. Перед нанесением раствора S-A-H-R-P используйте количество реагента, достаточное для полного покрытия среза ткани.

После накрытия предметных стекол инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации промойте стекла трижды по пять минут каждое. Непосредственно перед использованием приготовьте растворstock-раствора флуоресцентного красителя с разведением от 1:50 в буфере для промывки TNT и 1x разбавителе для амплификации. Пипеткой нанесите раствор на предметные стекла, полностью покрыв срез ткани.

Поскольку раствор нельзя использовать повторно, утилизируйте любой оставшийся неиспользованный объем. Инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре от 3 до 10 минут. Контролируйте флуоресценцию.

Увеличьте кратность микроскопа до тех пор, пока не появятся первые признаки структур. Затем быстро переходите к этапу промывки. Промойте предметные стекла трижды, по пять минут каждый раз.

В буфере для промывки TNT при комнатной температуре с перемешиванием. После промывки добавьте раствор для предотвращения выцветания с DPI и накройте покровным стеклом. Оцените результаты с помощью флуоресцентного микроскопа.

На этих изображениях представлены два примера кислотного клиренса PHA. Ядерный краситель dappy отображен синей флуоресценцией, а зонд liable vac topo — зеленой флуоресценцией. Схемы событий, представленных на этих изображениях, демонстрируют ядра фагоцитов и поглощенные ими внеклеточные ядра на различных стадиях переваривания. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает около трех часов.

После просмотра этого видео вы узнаете, как использовать жизнеспособные флуоресцентные зонды в срезах тканей. Вы также сможете селективно маркировать активные иды, отсеивая погибшие клетки в ишемизированном мозге.