Оценка фагоцитарной оформление гибель клеток в экспериментальной инсульта на Ligatable флуоресцентных зондов

Общая цель этой процедуры заключается в выборочной маркировке активных фагоцитарных клеток, которые удаляют клеточные трупы при инсульте. Это достигается путем предварительной подготовки компонентов для реакции усиления сигнала на основе Tite. Второй шаг – подготовка разделов.

Далее проводят реакцию мечения с помощью фермента коровьей оспы, топоизомеразы и соответствующих флуоресцентных зондов. Заключительным этапом является усиление флуоресцентного сигнала на основе IDE. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для оценки фагоцитарного клиренса мертвых клеток в тканевых срезах очаговой ишемии мозга.

Выведение мертвых клеток фагоцитами играет важную роль в восстановлении мозга после ишемии. Представленный метод определяет эффективность данного процесса путем маркировки только тех размеров пего, которые активно удаляют омертвевшие клетки. Хотя этот метод дает представление об ишемическом мозге, он также может быть использован для изучения ишемического повреждения в других органах и тканях.

Где важен кислотный клиренс ЖК от мертвых клеток. Хотя этап усиления сигнала IDE или TSA происходит на заключительном этапе мечения, подготовка к этой реакции может занять более часа. Поэтому удобнее использовать реагенты TSA First.

Первым делом необходимо изготовить стоковый раствор TYROM в концентрации 300 микролитров ДМСО на файлы реагентов tyrom, входящие в комплект для маркировки TSA. Далее приготовьте промывочный буфер для тротила для полного растворения блокирующего реагента. При изготовлении блокирующего буфера TNB медленно добавляйте его небольшими шагами, помешивая, нагревайте раствор постепенно до 55 градусов Цельсия.

При непрерывном помешивании раствор будет казаться молочным и его следует довести до комнатной температуры перед использованием аликвоты и хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия для длительного использования для этой процедуры, предметные стекла готовят заранее, монтируя секции толщиной пять микрометров. Вырезают из формалина неподвижную ткань. Сначала обрабатывайте срезы ксилолом в течение 15 минут, регидратируйте срезы с помощью серии промывок этанолом, а затем дважды промывайте водой.

Далее вносят рабочий раствор протеиназы К, разводя стоковый раствор до 50 мкг на миллилитр в PBS. Наиболее сложной частью этого эксперимента является определение идеальной продолжительности времени для контроля пищеварения протеиназы К, при этом для обеспечения успеха может потребоваться как более короткое, так и более длительное время переваривания. Добавьте в срезы соответствующий объем белка рабочего раствора ACE K и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 23 градуса Цельсия.

После инкубации промойте срезы в дистиллированной воде два раза по пять минут каждый. Пока срезы замачиваются, приготовьте маркировочную смесь, содержащую активный зонд. Чтобы приготовить раствор активного зонда, соедините олигонуклеотиды с водой с одним молярным триссом, HCL и входящей в комплект топоизомеразой коровьей оспы, аккуратно перемешайте пипетированием и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы обеспечить активацию зонда.

После второго периода промывки возьмите срезы из банки и отоберите оставшуюся воду. Когда все будет готово, нанесите активный раствор зонда на приготовленную ранее крышку. Наденьте секции и инкубируйте их в течение 15 минут при температуре 23 градуса Цельсия.

После инкубации опустите стекла в воду, чтобы аккуратно удалить покровные стекла. Промойте горки в воде три раза по пять минут каждый. После последней промывки накройте срезы ткани буфером, блокирующим TNB, и выдержите предметные стекла во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре.

За это время приготовьте один к 100 разведению стрипированных и пероксидазных конъюгатов хренской редьки. S-A-H-R-P в блокирующем буфере TNB, извлекаем предметные стекла и отсасываем блокирующий буфер TNB. Перед нанесением раствора S-A-H-R-P используйте достаточное количество реагента, чтобы покрыть весь участок ткани.

После накрытия вымойте предметные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре После инкубации промойте предметные стекла три раза по пять минут каждое. В промывочном буфере TNT при комнатной температуре приготовьте разбавление от одного до 50 фторсодержащих четырех TY IDE в одном разбавителе x amplification непосредственно перед использованием. Нанесите раствор пипеткой на предметные стекла, полностью покрывающие участок ткани.

Поскольку раствор нельзя использовать повторно, выбросьте оставшуюся неиспользованную порцию. Выдержите предметные стекла при комнатной температуре от трех до 10 минут. Следите за флуоресценцией.

Увеличивайте под микроскопом до тех пор, пока в это время не станут видны первые намеки на структуры. Быстро приступайте к этапу стирки. Промойте горки три раза по пять минут каждый.

В тротиле промойте буфер при комнатной температуре с перемешиванием. После стирки добавьте раствор против выцветания с DPI и накройте крышкой. Наблюдайте за результатами под флуоресцентным микроскопом.

На этих изображениях показаны два примера кислотного клиренса PHA. Пятно ядра показано синим флуоресцентным цветом, а соответствующий вакуумный топозонд показан зеленым флуоресцентным графиком событий, представленных на этих изображениях, показаны ядра фагоцитов и поглощенных тиком дополнительных ядер на различных стадиях пищеварения. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за три часа, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео вы узнаете, как использовать подходящие флуоресцентные зонды на срезах тканей. Вы также сможете выборочно помечать активные идеи, очищающие от мертвых клеток в ишемизированном мозге.