Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода

Общая цель этой процедуры заключается в выделении митохондрий, связанных с трансляцией мРНК. Это достигается путем предварительного сбора дрожжевых клеток, выращенных в условиях обогащения митохондрий. Вторым шагом является аккуратное вшейникование клеток в присутствии циклохейде.

Далее митохондрии отделяются от растворимых компонентов с помощью дифференциального центрифугирования. Заключительным этапом является экстракция РНК из митохондрий и контрольных образцов. В конечном счете, анализ Нортерна используется для того, чтобы показать чистоту и качество РНК, ассоциированной с митохондриями.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что в одном препарате можно выделить множество типов РНК. Поэтому можно провести сравнительный анализ. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, такие как внутриклеточное нацеливание и функция органов.

При этой процедуре митохондрии будут очищены от 100 до 150. Миллилитры дрожжевых клеток выросли до наружного диаметра 600 от одного до 1,5 при 30 градусах Цельсия при неферментируемом росте. Терпимая. Центрифугируйте ячейки при 3000-кратной гравитации в течение пяти минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте гранулу центрифугой с двойной дистиллированной водой.

После отбрасывания надосадочной жидкости взвесьте клеточную гранулу. Обычно из 100 миллилитров клеток получают около 0,6 грамма. Резус суспендируют в одном миллилитре буфера DTT на 0,5 грамма клеток.

Важно обрабатывать клетки восстановителем для того, чтобы разорвать дисульфидные связи внутри клеточной стенки, тем самым улучшая гидролиз, инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 30 градусов Цельсия с легким встряхиванием. Затем центрифугируйте ячейки при 3000-кратной гравитации в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу.

В одном миллилитре xmal лиаза буфер на 0,15 грамма клеток не завихриваются. Измерьте наружный диаметр 600 10 микролитров аликвоты клеток в 990 микролитрах воды и запишите это значение. Добавьте в клетки свежеприготовленную лиазу xmal для гидролиза полимеров глюкозы в бета-трех связях и получения Sphero plast.

С этого момента Сферо пласт следует выдерживать в изотоническом растворе во избежание лизиса, инкубировать клетки в течение 15 минут при температуре 30 градусов Цельсия с легким встряхиванием. Чтобы проверить гидролиз клеточной стенки и сферы образования пластов, смешайте 10 микролитров клеток с 990 микролитрами воды и измерьте наружный диаметр 600 Sphero Plats, в которых ожидается образование вшей из-за осмотической разницы, а наружный диаметр 600 должен быть как минимум в десять раз меньше значения, определенного до добавления xmal лиазы. Если нет, продолжайте инкубацию с xmal liase еще 15 минут.

Повторно суспендируйте PHE пласта со 100 миллилитрами восстановительной среды и перенесите сферу пласта в колбу Helen Meyer. Выдерживать в течение одного часа при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием. Этот этап восстановления необходим, так как во время лечения XY происходит остановка трансляции и нарушается локализация мРНК.

Через час добавьте 0,1 миллиграмма на миллилитр, циклохейде, и переложите пласт Sphero в предварительно охлажденные 50-миллилитровые конические трубки. Cyclo Heide edition важен для замораживания ассоциации рибосом с мРНК. Таким образом, рибосомно-зависимая мРНК-связь с митохондриями сохраняется.

Центрифуга, сфера площади в 3000 раз сильнее силы тяжести в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте холодным маннитолом. Buffer reus.

Подвесьте сферу пласта с четырьмя миллилитрами холодного манитолового буфера и переложите суспензию в пуховый гомогенизатор емкостью 15 миллилитров, оснащенный плотно прилегающим пестом. Аккуратно разбейте сферу пласта 15 ударами и переложите лизат в 13-миллилитровую трубку. Центрифугируйте лизат при давлении в 1,500 раза сильнее силы тяжести в течение шести минут при четырех градусах Цельсия.

Для гранулирования ядер и неразрывных клеток. Аккуратно переложите супер натин в новую трубку. Отложите один миллилитр или 25% пробы в качестве нефракционированной или общей пробы.

Переложите 50 микролитров этого образца в новую пробирку и добавьте 15 микролитров четырех XLSB. Для западного анализа крови РНК будет осаждена из остальной части общего образца для северного анализа и анализа микрочипов. Центрифугируйте супернатин при 10 000 раз.

Сила тяжести в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы гранулировать митохондрии, перенесите супер натин в новую трубку и держите его на льду. Это и есть цитозольная фракция.

Переложите 50 микролитров этого образца в новую пробирку и добавьте 15 микролитров четырех XLSB. Для вестерн-блоттинга РНК будет осаждена из остальной части цитозольного образца для северного и микрочипового анализов. Промойте гранулу с тремя миллилитрами маннита, буферизуйте и снова центрифугируйте 10 000 раз.

Сила тяжести в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Ройс суспензирует гранулу с тремя миллилитрами маннитолового буфера. Этот образец содержит митохондрии и называется фракцией митохондрий.

Перелейте 50 микролитров этого образца в новую пробирку и добавьте 15 микролитров четырех XLSB для вестерн-блоттинга. Чтобы начать эту процедуру, добавьте к каждому образцу по одному объему восьми моляров гуад дия, HCEL и два объема вихря 100% этанола и инкубируйте не менее двух часов при температуре минус 20 градусов Цельсия. Центрифугируйте образцы при 10 000-кратной гравитации в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте надосадочную жидкость. Будьте осторожны, так как гранула может быть неустойчивой. После промывки гранулы с 70%-ным этанолом суспензируйте гранулу 400 микролитрами свободной от РНК воды и перенесите образец в новую пробирку эйнора.

Снова осадите РНК, добавив 0,1 объема трех моляров ацетата натрия pH 5,2 и два объема вихря 100% этанола и инкубируйте в течение не менее двух часов при температуре минус 20 градусов Цельсия. Центрифугируйте образцы при 20 000 раз. Гравитация в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте надосадочную жидкость и постирайте с 70% этанолом. Высушите гранулы на воздухе и восстановите суспензию с РНК без РНК для хранения РНК. Образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Образцы впоследствии могут быть использованы для анализа по Северу или с помощью микрочипов. Чтобы подготовить РНК к анализу микрочипов, сначала суспензируют каждую гранулу мРНК, полученную из guin HCL и осаждения этанола, с 650 микролитрами свободной воды РНК и переносят в пробирку с завинчивающейся крышкой. Затем добавьте 650 микролитров кислого фенола, хлороформа и энергично центрифугируйте на максимальных оборотах в течение двух минут.

Переложите 500 микролитров верхней водной фазы в новую пробирку. Избегайте использования интерфазы, так как она содержит ДНК. Также будьте осторожны и избегайте приема фенола, который может ингибировать реакцию обратной транскрипции.

Удалить гепарин из образца РНК путем осаждения хлорида лития. Добавьте хлорид лития до конечной концентрации в два моляра и инкубируйте образцы в течение ночи при температуре минус 20 градусов Цельсия на следующий день. Разморозьте образцы при четырех градусах Цельсия и центрифугируйте при 20 000 раз.

Гравитация в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу центрифугой с 80% этанолом. Снова выбросьте надосадочную жидкость на воздухе, высушите и повторно суспендируйте гранулу В 150 микролитрах свободной РНК воды, чтобы удалить остаточный осадок хлорида лития, снова с 0,1 объемом трех моляров ацетата натрия pH 5,3 и тремя объемами 100% этанола инкубируйте при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение не менее двух часов.

Центрифугируйте на максимальной скорости в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно промойте прозрачные гранулы с 80% этанолом и высушите на воздухе. Наконец, суспендируйте гранулу 25 микролитрами свободной воды из РНК и держите образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Успех этого протокола в отделении митохондрии, содержащей фракцию, от цитозольных компонентов лучше всего проверяется путем проведения северного и западного анализа образцов с различных этапов выделения. В этом примере образцы были взяты до фракционирования или общей фракцией, цитозольной фракцией и митохондриальной фракцией. Норн-анализ проводили для следующих мРНК, КОБ и РНК.

Он транскрибируется внутри митохондрий, CO и мРНК, которая кодирует белок, импортируемый в митохондрии. CT-один, Mr.Nna, который кодирует цитозольный актиновый белок, и SEC 61 an Mnna, который кодирует резидентный белок ER. Нижняя панель представляет собой метиленовое синее окрашивание северной мембраны, где обнаружены две заметные полосы РНК 25 s и 18 s.

Поскольку КОБ транскрибируется внутри митохондрий, его сигнал должен быть исключительно в митохондриях. Что и было отмечено в данном исследовании. Появление КОБ в цитозольной фракции будет свидетельствовать о лизисе митохондрий во время приготовления.

ACO one кодирует белок, который импортируется в митохондрии и появляется в основном в митохондриальной фракции. КТ кодирует цитозольный белок и поэтому появляется в основном в цитозольной фракции. Наличие SEC 61 в митохондриальной фракции указывает на наличие компонентов ER в этой фракции.

Сигналы РНК появляются в обеих фракциях, что указывает на наличие рибосом. Вестерн-анализ был проведен для следующих белков: POR one A mitochondria, белок наружной мембраны hx, K one A, цитозольный белок CUE one, а также белок ER и RPL 39. Рибосомный белок, как и ожидалось, был обнаружен только в митохондриальной фракции.

Если бы в цитозольной фракции был обнаружен один сигнал POR, это указывало бы на диссоциацию митохондриальных компонентов во время приготовления. Кроме того, как и ожидалось, hx K one был обнаружен только в цитозольной фракции. Сильный сигнал CUE one в митохондриальной фракции указывает на то, что значительное количество материала, связанного с ER, соизолировано в митохондриальной фракции.

Это может быть результатом известных физических контактов между ЭР и митохондриями. Сигнал RPL 39 появляется в обеих фракциях, опять же, подтверждая наличие рибосом в обеих фракциях, исключая этап восстановления из процедуры, приводит к исчезновению рибосом из фракции M, что повлияет на ассоциацию мРНК с митохондриями. В дополнение к проверке качества разделения между митохондриальными и цитозольными компонентами, важно подтвердить, что РНК или белки в образцах не повреждены и нет серьезных потерь РНК или белков во время подготовки образцов.

Интактные РНК и белки должны быть обнаружены в анализах как отдельные полосы, как показано здесь. Для c CCP одной мРНК, которая кодирует белок, импортируемый в митохондрии, появление дополнительных более коротких полос или мазков будет указывать на деградацию. Серьезные потери приведут к существенной разнице между общим и относительным количеством сигнала, который не наблюдался, взятым вместе.

Эти результаты подтверждают, что данный протокол является эффективным методом выделения мРНК, рибосом и белков в рамках одной процедуры. После этой процедуры могут быть выполнены полногеномные методы, такие как RNA-Seq или протеомный анализ, чтобы определить ключевые и уникальные особенности функций органа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить РНК, связанную с митохондриями.