Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода

Общая цель данной процедуры заключается в выделении митохондрий, связанных с транслируемыми мРНК. Это достигается путем первоначального сбора клеток дрожжей, выращенных в условиях, способствующих обогащению митохондриями. Вторым этапом является бережный лизис клеток в присутствии циклогексимида.

Затем митохондрии отделяют от растворимых компонентов с помощью дифференциального центрифугирования. Заключительным этапом является экстракция РНК из митохондрий и контрольных образцов. В конечном итоге для подтверждения чистоты и качества РНК, ассоциированной с митохондриями, используется нозерн-блот-анализ.

Основным преимуществом данного метода является возможность выделения многих типов РНК в рамках одной пробы. Это позволяет проводить сравнительный анализ. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов клеточной биологии, таких как внутриклеточный таргетинг и функции органелл.

В данной процедуре митохондрии будут очищены из 100–150 мл дрожжевых клеток, выращенных до OD 600 от 1 до 1,5 при 30 °C на неферментируемой питательной среде. Центрифугируйте клетки при 3000 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре, удалите супернатант и промойте осадок дважды дистиллированной водой, после чего снова центрифугируйте.

После удаления супернатанта взвесьте осадок клеток. Обычно из 100 миллилитров клеточной суспензии получают около 0,6 грамма осадка. Ресуспендируйте осадок в DTT-буфере из расчета 1 миллилитр на 0,5 грамма клеток.

Важно обработать клетки восстановителем для разрыва дисульфидных связей в клеточной стенке, что способствует улучшению гидролиза; инкубируйте клетки в течение 10 минут при 30 °C при осторожном встряхивании. Затем центрифугируйте клетки при 3000 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок.

В одном миллилитре буфера xmal liase на 0,15 грамма клеток не используйте вортекс. Измерьте OD 600 аликвоты клеток объемом 10 µL в 990 µL воды и запишите полученное значение. Добавьте к клеткам свежеприготовленный xmal liase для гидролиза полимеров глюкозы по β-1,3-связям глюкана и получения сферопластов.

С этого момента сферопласты следует содержать в изотоническом растворе во избежание лизиса; инкубируйте клетки в течение 15 минут при 30 °C при осторожном встряхивании. Чтобы подтвердить гидролиз клеточной стенки и образование сферопластов, смешайте 10 µL клеточной суспензии с 990 µL воды и измерьте OD 600. Ожидается, что сферопласты подвергнутся лизису из-за осмотической разности, и значение OD 600 должно быть как минимум в десять раз меньше значения, определенного до добавления xmal liase. Если это не так, продолжите инкубацию с xmal liase еще в течение 15 минут.

Ресуспендируйте PHE пластмассы в 100 миллилитрах восстанавливающей среды и перенесите сферу пластмассы в колбу Хелена Мейера. Инкубируйте в течение одного часа при 30 °C с перемешиванием. Этот этап восстановления необходим, поскольку во время обработки XYs трансляция прекращается, а локализация мРНК нарушается.

Через один час добавьте циклогексимид в концентрации 0,1 mg/mL и перенесите сферопласты в предварительно охлажденные конические пробирки объемом 50 mL. Добавление циклогексимида необходимо для фиксации ассоциации рибосом с мРНК. Таким образом поддерживается рибосом-зависимая ассоциация мРНК с митохондриями.

Центрифугируйте сферу плазмы при 3000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Удалите супернатант и дважды промойте холодным маннитным буфером.

Ресуспендируйте сферу Plass в 4 мл холодного маннитольного буфера и перенесите суспензию в гомогенизатор объемом 15 мл, оснащенный плотно прилегающим пестиком. Осторожно разрушите сферу Plass, совершив 15 движений пестиком, и перенесите лизат в пробирку объемом 13 мл. Центрифугируйте лизат при 1 500 ×g в течение шести минут при температуре 4 °C.

Для осаждения ядер и неразрушенных клеток. Осторожно перенесите супернатант в новую пробирку. Отберите один миллилитр или 25% образца в качестве нефракционированного или общего образца.

Перенесите 50 µL этого образца в новую пробирку и добавьте 15 µL четырех XLSB. Для вестерн-блот-анализа РНК будет осаждена из остальной части общего образца для северного блоттинга и микроматричного анализа. Центрифугируйте супернатант при 10 000 ×g.

Центрифугирование при g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Чтобы осадить митохондрии, перенесите супернатант в новую пробирку и храните его на льду. Это цитозольная фракция.

Перенесите 50 µL данного образца в новую пробирку и добавьте 15 µL четырех XLSB. Для вестерн-блот-анализа РНК будет осаждена из остальной части цитозольного образца для северного блоттинга и микрочипового анализа. Промойте осадок тремя миллилитрами маннитного буфера и повторно центрифугируйте при 10,000 ×g.

Центрифугируйте при температуре 4 °C в течение 10 минут. Ресуспендируйте осадок в 3 мл маннитольного буфера. Данный образец содержит митохондрии и называется митохондриальной фракцией.

Перенесите 50 µL данного образца в новую пробирку и добавьте 15 µL буфера XLSB для анализа методом вестерн-блоттинга. Чтобы начать эту процедуру, добавьте к каждому образцу один объем 8 M гуанидина, HCEL и два объема 100% этанола, перемешайте на вортексе и инкубируйте не менее двух часов при -20 °C. Центрифугируйте образцы при 10 000 ×g в течение 20 минут при 4 °C.

Удалите супернатант. Будьте осторожны, так как осадок может быть нестабильным. После промывки осадка 70% этанолом ресуспендируйте его в 400 µL воды, свободной от РНКаз, и перенесите образец в новую пробирку типа «эппендорф».

Повторно осадите РНК, добавив 0,1 объема трехмолярного ацетата натрия (pH 5.2) и два объема 100% этанола; перемешайте на вортексе и инкубируйте не менее двух часов при -20 °C. Центрифугируйте образцы при 20 000 ×g в течение 20 минут при 4 °C.

Удалите супернатант и промойте осадок 70% этанолом. Высушите осадок на воздухе и ресуспендируйте в воде, свободной от РНКаз. Храните образцы РНК при температуре -80 °C.

Полученные образцы в дальнейшем можно использовать для северного блоттинга или микрочипового анализа. Для подготовки РНК к микрочиповому анализу сначала ресуспендируйте каждый осадок мРНК, полученный путем осаждения с помощью гуинин-HCl и этанола, в 650 µL РНКазы-свободной воды и перенесите в микроцентрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой. Затем добавьте 650 µL кислого фенол-хлороформного раствора, тщательно перемешайте на вортексе и центрифугируйте на максимальной скорости в течение двух минут.

Перенесите 500 µL верхней водной фазы в новую пробирку. Старайтесь не захватить интерфазу, так как она содержит ДНК. Также будьте осторожны, чтобы не допустить попадания фенола, который может ингибировать реакцию обратной транскрипции.

Удалите гепарин из образца РНК путем осаждения хлоридом лития. Добавьте хлорид лития до конечной концентрации 2 M и инкубируйте образцы в течение ночи при -20 °C. На следующий день разморозьте образцы при 4 °C и центрифугируйте при 20 000 ×g.

Центрифугирование при воздействии силы тяжести в течение 20 минут при температуре 4 °C. Осторожно слейте супернатант и промойте осадок 80% этанолом с помощью центрифугирования. Снова слейте супернатант, высушите осадок на воздухе и ресуспендируйте его в 150 µL свободной от РНК воды; чтобы удалить остатки осадка хлорида лития, снова добавьте 0,1 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,3) и три объема 100% этанола, затем инкубируйте при температуре -20 °C не менее двух часов.

Центрифугируйте на максимальной скорости в течение 20 минут при температуре 4 °C. Осторожно промойте прозрачный осадок 80% ethanol и высушите на воздухе. В завершение ресуспендируйте осадок в 25 µL воды, свободной от РНКаз, и храните образцы при температуре -80 °C.

Успешность данного протокола по отделению фракции, содержащей митохондрии, от цитозольных компонентов лучше всего проверить, проведя северный и вестерн-блоттинг анализы образцов, полученных на разных этапах изоляции. В данном примере использовались образцы до фракционирования (общая фракция), цитозольная фракция и митохондриальная фракция. Северный анализ проводился для следующих мРНК: COB и RNA.

Это транскрибируется внутри митохондрий: мРНК CO1, которая кодирует белок, импортируемый в митохондрии; мРНК ACT1, которая кодирует цитозольный белок актин; и мРНК SEC61, которая кодирует резидентный белок ЭПР. На нижней панели представлено окрашивание мембраны метиленовым синим, где обнаруживаются две выраженные полосы РНК — 25 s и 18 s.

Поскольку COB транскрибируется внутри митохондрий, его сигнал должен обнаруживаться исключительно в митохондриях, что и наблюдалось в данном исследовании. Появление COB в цитозольной фракции будет свидетельствовать о лизисе митохондрий в процессе подготовки образцов.

ACO 1 кодирует белок, который импортируется в митохондрии и содержится преимущественно в митохондриальной фракции. ACT 1 кодирует цитозольный белок и, следовательно, содержится преимущественно в цитозольной фракции. Присутствие SEC 61 в митохондриальной фракции указывает на наличие в этой фракции компонентов ЭР.

Сигналы РНК обнаруживаются в обеих фракциях, что указывает на присутствие рибосом. Вестерн-анализ был проведен для следующих белков: POR1 — митохондриальный белок внешней мембраи, HK1 — цитозольный белок, CUE1 — белок ЭР и RPL39 — рибосомальный белок. Как и ожидалось, сигнал POR1 был обнаружен только в митохондриальной фракции.

Если бы сигнал POR 1 был обнаружен в цитозольной фракции, это указывало бы на диссоциацию митохондриальных компонентов в процессе подготовки. Кроме того, как и ожидалось, hx K 1 был обнаружен только в цитозольной фракции. Сильный сигнал CUE 1 в митохондриальной фракции свидетельствует о том, что значительное количество материала, связанного с ЭР, ко-изолируется в митохондриальной фракции.

Это может быть следствием известных физических контактов между ЭР и митохондриями. Сигнал RPL 39 обнаруживается в обеих фракциях, что вновь подтверждает присутствие рибосом в обеих фракциях; исключение этапа восстановления из процедуры приводит к исчезновению рибосом из фракции M, что повлияет на ассоциацию мРНК с митохондриями. Помимо проверки качества разделения митохондриальных и цитозольных компонентов, важно подтвердить, что РНК или белки в образцах не повреждены и в процессе подготовки образцов не произошло значительных потерь РНК или белков.

В ходе данного анализа неповрежденные РНК и белки должны определяться в виде отдельных полос, как показано здесь. Для одного из мРНК c CCP, кодирующего белок, импортируемый в митохондрии, появление дополнительных более коротких полос или «шлейфов» будет указывать на деградацию. Сильные потери привели бы к значительному различию между общим и относительным количеством сигнала, чего в совокупности наблюдалось не было.

Эти результаты подтверждают, что данный протокол является эффективным методом выделения мРНК, рибосом и белков в рамках одной процедуры. После выполнения данной процедуры можно провести полногеномные исследования, такие как RNA-Seq или протеомный анализ, для выявления ключевых и уникальных особенностей функций органелл. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выделять РНК, ассоциированную с митохондриями.