Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images

Здесь мы опишем рабочий процесс для быстрого анализа и изучения коллекций флуоресцентной микроскопии изображений с помощью PhenoRipper, недавно разработанной анализа изображений платформу.

Общая цель этой процедуры заключается в использовании платформы анализа изображений для быстрого анализа и изучения изображений флуоресцентной микроскопии. Это достигается путем предварительного посева ячеек в планшет, добавления возмущений в каждую лунку и инкубации планшета. Затем изображения получают с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа, а изображения полуавтоматически загружаются на платформу анализа изображений pheno ripper с помощью инструмента загрузчика pheno.

После установки параметров анализа pheno ripper автоматически идентифицирует повторяющиеся типы блоков на изображениях и генерирует фенотипические профили для каждого изображения, которые можно исследовать с помощью pheno browser. В конечном счете, итоговая диаграмма кластера показывает взаимосвязи между различными условиями и особенностями изображения, что позволяет сравнивать сложные, но тонкие фенотипы, созданные высокопроизводительным экраном визуализации. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, требующими автоматизированной идентификации отдельных клеток, заключается в том, что она намного быстрее и проще в использовании.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биомедицинской сфере, например, как различные лекарства влияют на клеточные процессы. Эта процедура начинается с культивирования клеток и фиксации клеток, как описано в текстовом протоколе: окрашивание фиксированных клеток с использованием специфических первичных антител, флуоресцентно меченных вторичных антител и других флуоресцентных красителей, которые можно найти в текстовом протоколе. После окрашивания клеток получите изображения с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.

В этом примере мы использовали 20-кратное увеличение с помощью камеры «один за другим». Беннинг. Мы получили по 16 снимков по каждой скважине, всего 480 снимков. Чтобы проанализировать изображения, сначала скачайте и установите pheno ripper от pheno ripper.

org и запустить Pheno Ripper. Чтобы начать анализ изображений для полуавтоматической загрузки изображений и связанных с ними метаданных, нажмите на структуру файла, чтобы получить доступ к загрузчику pheno в загрузчике pheno. Выберите директорию, содержащую набор данных изображений, и при необходимости укажите расширение файла изображений.

Фильтруйте файлы, которые не используются для анализа. Нажмите «Определить маркеры», чтобы указать биомаркеры, используемые в эксперименте, и связать их с изображениями. В частности, нажмите на файл изображения, а затем выберите часть пути к файлу, которая однозначно идентифицирует биомаркеры.

Наконец, введите имя для каждого биомаркера. Следующим шагом будет нажатие на кнопку «Определить метаданные». Чтобы связать информацию с каждым изображением, щелкните файл изображения, а затем выберите часть пути к файлу, идентифицирующую информацию об изображении.

Появится окно с запросом названия группы. Введите имя. Члены группы, извлеченные из имени файла, будут отображаться в таблице групп.

Эта информация может быть использована при визуализации результатов анализа. Чтобы добавить дополнительную информацию, отсутствующую в имени файла, нажмите кнопку «Добавить дополнительную информацию», затем выберите «Добавить группу метаданных» и введите имя дополнительной группы. После каждого значения для предопределенной группы количество дополнительных групп, которые могут быть добавлены, не ограничено.

Наконец, нажмите кнопку «Создать файл метаданных», чтобы сгенерировать читабельную аннотацию данных, выберите поле метаданных, определяющее репликации в эксперименте, чтобы избежать избыточной выборки. Для набора данных, содержащего реплики, их группировка может повысить производительность. Затем нажмите на set parameters, чтобы определить параметры, необходимые для обработки набора данных.

Параметры, которые необходимо определить, находятся на левой панели. Появятся дисплеи на правой панели. Пример набора данных.

Нажмите слева или справа. Стрелки для переключения между различными изображениями - это выбор подходящего порогового значения для приблизительной идентификации клеточных частей изображений. Пороговое значение предварительно вычисляется с помощью phenoripper, но может быть скорректировано для улучшения выделения клеточных областей с помощью полосы прокрутки, доступной в верхней части изображения.

Если выбранный порог работает не для всех изображений, уменьшите порог, чтобы включить неклеточные области, а не отбрасывать клеточные области. Затем выберите подходящий размер блока, измеряемый в пикселях, чтобы разделить изображение на сетку блоков. Отрегулируйте размер блока так, чтобы получить в среднем от 20 до 30 блоков на ячейку для наложения сетки на изображение.

Нажмите на флажок напротив поля размера блока. Если автоматически масштабированные изображения не отображают маркеры с желаемой относительной интенсивностью или если маркеры необходимо исключить из анализа, используйте параметр «Настроить интенсивность канала» для определения клеточных областей на подмножестве маркеров. Выберите каналы, используемые для параметра порогового значения по умолчанию.

Выбор других параметров обычно достаточен, но при необходимости скорректируйте его. Используя расширенные параметры анализа, запустите анализ, нажав pheno rip на главной панели приложения. Pheno ripper автоматически определит повторяющиеся типы блоков на изображениях.

Фенотипические профили будут сгенерированы для каждого изображения на основе дробей различных типов блоков в нем. Исследуйте взаимосвязи между фенотипическими профилями изображений с помощью фенобраузера. Интерфейс браузера pheno состоит из четырех панелей.

Верхняя левая панель представляет собой графическое представление относительного сходства между различными изображениями и экспериментальными условиями. На двух панелях справа отображаются образцы изображений выбранных условий. На итоговой панели сравниваются фенотипические профили выбранных условий.

Сначала отключите группировку в меню обработки данных, чтобы изучить отдельные изображения. Затем щелкните по точкам выброса на точечной диаграмме и отбросьте изображения низкого качества. Решите, какое поле метаданных определяет базовую единицу сравнения.

Например, для сравнения лекарств сгруппируйте изображения с одинаковым значением поля метаданных drug. Каждая точка теперь представляет собой отдельный препарат с помощью меню отображения данных, цветовых точек или точек маркировки на основе доступных метаданных для облегчения интерпретации. Расстояние между точками отражает относительное фенотипическое сходство соответствующих условий эксперимента.

Более близкие точки предполагают больше сходства. Трехмерный график можно поворачивать, установив флажок Вращаться. Перетащите мышь на график, удерживая нажатой левую кнопку мыши.

Выберите две разные точки, чтобы сравнить их напрямую. На панелях изображений будут отображаться образцы изображений для каждой точки, а на панели линейчатой диаграммы будут показаны типы блоков, которые лучше всего различают две точки. Запустите кластерный грамм из меню кластерного грамма, чтобы получить более глобальное представление о взаимосвязи между типами блоков и экспериментальными условиями путем группировки типов блоков и условий.

Это представление выделяет клеточные фенотипы, которые лучше всего различают группы состояний. Pheno ripper был использован для анализа hela-клеток, которые были флуоресцентно окрашены на ДНК-актон и альфа-тубулин и визуализированы после обработки гистондеацетилазой, ингибирующей нацеливание на микротрубочки и повреждающими ДНК препаратами. Порог переднего плана этих изображений был установлен на уровне 5%, а размер блока до 20 пикселей Анализ этого набора данных занял примерно 10 минут на стандартном настольном компьютере.

Для изучения результатов использовался интерфейс браузера pheno. Относительное фенотипическое сходство между изображениями визуализируется с помощью многомерного шкалирования. Каждая точка представляет собой отдельное изображение, окрашенное в соответствии с механизмом действия препарата.

Этот график показывает, что фенотипические профили могут быть использованы для группировки лекарств по механизму их действия. Артефакты визуализации, такие как окрашивание пор и пустые кадры, было легко идентифицировать, поскольку они выделялись как явные выбросы. Кластерный грамм данных связывает эту группировку с фенотипическими профилями здесь.

Каждая строка представляет один препарат, а каждый столбец — блочный тип. Значения шкалы серого отражают фенотипические профили. Более низкое значение указывает на более высокую долю этого блочного типа: иерархическая кластеризация в значительной степени разделяет различные препараты по классам лекарств.

После освоения этой техники ее можно сделать за 10 минут, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как профилирование IRA. Это поможет ответить на дополнительные вопросы, например, о том, как разные гены влияют на сходные пути.