Активация и Измерение NLRP3 Inflammasome деятельности Использование IL-1β в человека моноцитов дендритные клетки

Общая цель следующих экспериментов заключается в наблюдении за активностью инфламмасом в дендритных клетках человека in vitro с использованием простых анализов считывания IL one beta. Сначала добавьте R 8 48 в клетки, чтобы индуцировать внутриклеточную экспрессию pro IL one beta. Затем добавьте ниге для активации NLRP образование трех инфламмосом.

Это, в свою очередь, запускает расщепление pro IL one beta до зрелого IL one beta перед секрецией. Затем соберите образцы и измерьте внутриклеточные результаты pro IL one beta и внеклеточного зрелого IL one beta, полученные путем измерения секреции IL one beta из праймированных и активированных клеток с помощью иммунофлуоресценции, вестерн-блоттинга и ELI. Обнаружение показало, что праймирование ДКБ человека приводит к внутриклеточной продукции pro IL one beta в клетках R 8 48 и секреции IL one beta из клеток, как праймированных, так и активированных нигерийским юрисом.

Этот метод может дать представление о роли инфламмасомы NLRP three в ответе дендритных клеток человека на синтетические лиганды. Он также может быть применен к другим системам, предназначенным для тестирования физиологических триггеров, таких как бактерии, вирусы и аутовоспалительные заболевания. Аликвота 200 микролитров свежевыделенных моноцитарных дендритных клеток в состоянии покоя в 96-луночной круглой нижней пластине.

Начните с четырех стандартных условий: нестимулированный негативный контроль, только прайминг, только активация и прайминг, за которым следует активация. Затем, в соответствии с экспериментальным планом, включить контроль разбавителя для R 8 48 и низсин для последующего внутриклеточного окрашивания цитокинов, анализы включают дубликаты для контроля изотипа для прайма инфламмасомы. Добавьте R 8 48, добавьте конечную концентрацию 10 микромоляров в соответствующие лунки.

Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на 18 часов. Затем, чтобы активировать NLRP три инфламмасомы, добавьте ниге в конечной концентрации 20 микромоля. Верните культуры в инкубатор еще на шесть часов для сбора образцов, центрифугируйте культуральный планшет при 974 перегрузке в течение трех минут, не нарушая клеточные гранулы.

Перенесите каждую надосадочную жидкость на отдельную круглую нижнюю пластину, чтобы измерить секрецию цитокинов по EISA. Теперь промойте клеточные гранулы три раза 200 микролитрами одного XPBS, чтобы удалить любой внеклеточный IL one beta из клеточных образцов для дальнейшего анализа с помощью различных методов западного блоттинга, детектирования pro IL one beta lyce непосредственно в 10 микролитрах денатурирующего лизисного буфера. После переноса лизатов в эйноровые пробирки объемом 1,5 миллилитра нагрейте образцы в течение 10 минут при 100 градусах Цельсия для флуоресцентного детектирования методом проточной цитометрии IL one beta.

Добавьте 100 микролитров 5%-ной среды PHS к клеточным образцам и 1 микролитр флуоресцентно меченных антител к маркерам фенотипа или контролю изотипа, инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. После трех промываний PBS зафиксируйте клетки 100 микролитрами 4%-ной PFA на 20 минут при комнатной температуре в темноте. Затем добавьте 100 микролитров проницаемого буфера в течение 30 минут, а затем 62 нанограмма анти-IL одного бета-антитела FSE или контрольного изотипа инкубируйте образцы в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.

Промойте клетки три раза 200 микролитрами проницаемого буфера и повторно суспендируйте в одном XPBS. Заверните образцы в фольгу и храните при температуре четыре градуса Цельсия. При обнаружении ИЛ одного бета с помощью микроскопии окрашивание клеток с помощью матриц, добавьте гору и аккуратно положите крышку на предметное стекло

Дайте горе затвердеть в течение ночи, прежде чем делать микроскопические изображения для обнаружения флуоресценции с помощью проточной цитометрии. Собирайте данные по одному образцу за раз. Установите передние и боковые разбросанные затворы на живых клетках Следующие затворы на CD 11 С положительные CD 14 отрицательные клетки.

Наконец, проанализируйте популяцию MODC на основе окрашивания pro IL one beta при сборе данных микроскопии. Установите время воздействия с положительным окрашиванием R 8 48 обработанного образца. Затем определите процент pro IL one beta, экспрессирующего MO dcs, легкость для обнаружения вестерн-блоттинга.

Загрузите общий объем образца на полиакриламидный гель. Работайте при напряжении 140 вольт, пока передняя часть матрицы не отсоединится от геля. Перенесите белок из полиакриламидного геля на A-P-V-D-F иммо на мембране FL.

Заблокируйте мембрану 5%-ным BSA в TBST на один час. Инкубируйте с первичным антителом, встряхивая при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. После трех пятиминутных промываний TBST инкубируют со вторичным антителом при комнатной температуре в течение одного часа, после чего еще три промывки TBST визуализируют мембрану при измерении секретируемых цитокинов с помощью ELI SA, уравновешивают образцы при комнатной температуре.

Открутите образцы вниз для закрепления надосадочной конденсации и следуйте инструкциям производителя по измерению IL one beta внутриклеточного окрашивания цитокинов для pro IL one beta позволяет проводить микроскопию и считывание фактов из CD 11 C положительного CD 14 отрицательного моноцитарного дендритного происхождения. Оба метода могут быть количественно определены относительно непрайм-контроля или контроля покоящейся клетки, а также контроля изотипа. Процент клеток окрашивания pro IL one beta умножается на геометрическую медиану этой популяции, чтобы получить медианную интенсивность флуоресценции.

MFI сопоставим с количеством pro IL one beta, присутствующего в клетках с положительным окрашиванием. Здесь. Методы иммуноблоттинга используются для измерения pro IL one beta из клеточных лизатов. Количественные данные выражаются относительно внутреннего клеточного контроля, такого как бета-тубулин, как и ожидалось.

Иммуноблоттинг для pro IL one beta в NI нигерийских клетках показывает снижение pro IL one beta. Это дополняется одновременным увеличением IL 1 beta в надосадочной жидкости, измеренным E ELI и только R 8 48, за которым следуют NI нигерийские условия. Одновременное измерение других воспалительных цитокинов, таких как T, NF, альфа, IL 10 и IL 6, гарантирует, что Нигер специфичен в причинении секреции IL one beta.

Уровень прайминга зависит от времени и дозы. Дальнейшие эксперименты, такие как измерение концентрации внеклеточного белка, обнаружение хемилюминесценции у зрелого поколения I one beta или блокирование инфламмасомы, помогут определить, является ли ex внеклеточный IO one beta зрелой расщепленной формой, а секреция IO one beta — nlrp. Активность трех инфламмасом в зависимости от нее.