Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Общая цель этой процедуры заключается в создании трехмерной хрящевой ткани человека для проверки возможности 3D-печати тканей с использованием модифицированного термоструйного принтера с одновременной фотополимеризацией. Это достигается путем предварительной модификации коммерчески доступного термоструйного принтера Hewlett Packard Desk jet 500 и картриджа с одноцветными чернилами 5 1 16 2 6 в биопринтер. Второй шаг заключается в том, чтобы объединить простую стадию 3D-печати и длинноволновую УФ-лампу для обеспечения мгновенной полимеризации впрыскиваемых биочернил в процессе производства.

Далее биочернила получают путем суспендирования расширенных суставных хондроцитов человека в 10% растворе полиэтиленгликоля в концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр. Заключительным этапом является послойная печать хрящевой ткани с одновременной фотополимеризацией. В конечном итоге конфокальная микроскопия и гистология.

Окрашивание используется для демонстрации равномерного распределения напечатанных хондроцитов в 3D-гидрогеле и превосходного производства хрящевого внеклеточного матрикса в гомогенном неохряще во время культивирования. Основное преимущество этой технологии перед существующими мерами, такими как полимеризация после ручного изготовления или сидячие ячейки после сканирования для изготовления, заключается в том, что напечатанные ячейки точно доставляются в тактильное место и остаются в положении матрицы. Вместо того чтобы думать до дна леса из-за силы тяжести, так он образует однородный патрон.

Модификация принтера, продемонстрированная в этом видео, основана на термоструйном принтере Hewlett Packard desk jet 500 и картридже с черными чернилами 5 1 6 2 6 а. Начните со снятия верхней пластиковой крышки принтера и осторожного отсоединения панели управления от крышки. Отсоедините три кабельных соединения между верхней частью принтера и основанием.

Затем снимите верхнюю часть принтера с основания. Затем из верхней части принтера удаляются небольшие пластиковые и резиновые аксессуары, входящие в состав системы очистки печатающей головки. Снимите основание лотка для бумаги с помощью пружин.

Металлическая пластина, закрывающая планку подачи пластиковой бумаги, также должна быть снята. Кроме того, планка подачи пластиковой бумаги должна быть отрезана в среднем положении подающего колеса, а два колеса подачи бумаги сняты. Для целей данного видео эти компоненты уже были удалены.

После очистки от пыли и мусора с помощью баллонов с воздухом и салфетками с этанолом прикрепите верхнюю часть принтера к основанию перед использованием ультрафиолета. Стерилизовал модифицированный принтер не менее двух часов в ламинарном вытяжном шкафу. Чтобы модифицировать чернильный картридж, сначала отрежьте от него колпачок.

С помощью ручной пилы слейте чернила и снимите фильтр, который прикрывает нижний колодец резервуара картриджа. Тщательно промойте картридж проточной водой из-под крана, чтобы удалить остатки ультра чернил. Ультразвуком окуните картридж в деионизированную воду в течение 10 минут.

Осмотрите картридж и убедитесь, что все чернила удалены. Тщательно распылите на картридж 70% этанола для стерилизации, а затем стерилизованную деионизированную воду. Наконец, установите длинноволновую УФ-лампу над печатной платформой, чтобы обеспечить одновременную фотополимеризацию.

Измерьте интенсивность ультрафиолета на печатной площадке с помощью УФ-экспонометра. Отрегулируйте расстояние между УФ-лампой и платформой принтера таким образом, чтобы интенсивность на объекте печати составляла от четырех до восьми милливатт на квадратный сантиметр. Это расстояние между лампой и платформой принтера должно составлять примерно 25 сантиметров.

Биочернила получают из хондроцитов человека для расширения хондроцитов в монослойной пластине. 5 миллионов хондроцитов человека в каждую колбу для культуры тканей T 1 75 для расширения клеток В DMEM дополняют 10% сыворотки теленка теленка и один пенициллин стрептомицина глутамина при 37 градусах Цельсия увлажненным воздухом, содержащим 5% углекислого газа. Меняйте питательную среду каждые три дня до тех пор, пока клетки не станут слитыми на 85%.

Используйте клетки из того же отрывка. Приготовьте полиэтиленгликоль DL или раствор педа. Растворите педа в PBS до конечной концентрации 10% от веса на объем.

Добавьте фотоинициатор I 2 9 5 9 до конечной концентрации 0,05% веса на объемный фильтр. Стерилизуйте раствор, когда культивируемые хондроциты человека сгущены на 85%. Соберите клетки после расчета концентрации клеток.

Переведите объем клеточной суспензии, необходимый для приготовления био в 5 миллионов клеток на миллилитр, в центрифугу с конической трубкой со скоростью 1200 об/мин в течение пяти минут. Чтобы гранулировать клетки, аспирируйте надосадочную жидкость и суспендируйте клетки в приготовленном растворе Pega с образованием биочернил. Чтобы начать эту процедуру, включите принтер и ноутбук с помощью Microsoft Word, создайте печатную выкройку из сплошного круга диаметром четыре миллиметра.

Поместите пластиковую форму в принтер. Отрегулируйте положение рисунка и убедитесь, что он будет точно печататься в пластиковой форме. Рассчитайте количество отпечатков, необходимых для достижения желаемой толщины каркаса.

Для роста в четыре миллиметра требуется 220 отпечатков для создания нужного каркаса. Загрузите биочернила в чернильный картридж. Накройте картридж алюминиевой фольгой для защиты от прямого воздействия ультрафиолетового излучения.

Во время печати отправьте команду печати на принтер. Когда принтер начнет печатать, потяните за датчик бумаги, чтобы продолжить печать. При отсутствии прохождения бумаги через принтер весь процесс печати должен занимать менее четырех минут для скафольда диаметром четыре миллиметра и высотой четыре миллиметра.

Перенесите напечатанный неохрящ в планшет на 24 лунки и добавьте в каждую лунку по 1,5 миллилитра питательной среды. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, инкубируйте напечатанный неохрящ в жизнеспособности живых мертвецов. Цитотоксичность рабочего раствора при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте, разрежьте нагруженную клеткой гидрогель пополам После получения флуоресцентных изображений области разреза, попросите слепого наблюдателя подсчитать живые и мертвые клетки на пяти случайно сделанных изображениях для расчета жизнеспособности клеток.

На этой фотографии показана репрезентативная печатная ткань неохряща диаметром четыре миллиметра и высотой четыре миллиметра, основанная на свойствах модифицированного термоструйного принтера. Для конструкции такого размера объем и толщина каждого напечатанного слоя при послойном построении составили 0,23 микролитра и 18 микрон соответственно. Весь процесс печати для создания неохрящевой ткани занял менее четырех минут.

На этих изображениях изображены хондроциты, помеченные зелеными и оранжевыми флуоресцентными красителями. На панели А показано равномерное распределение напечатанных хондроцитов в 3D-каркасе. Благодаря одновременной фотополимеризации окружающего каркаса во время осаждения ячейки, процесс печати и фотополимеризации был завершен за четыре минуты с жизнеспособностью ячейки 90%.

Потребовалось 10 минут воздействия ультрафиолета на гель, конструкцию того же размера, что и А, с жизнеспособностью клеток 63% шафрана, и окрашивание напечатанных хондроцитов в гидрогеле ПЭГ показало постепенное увеличение продукции протгликана во время культивирования, что указывает на конгенный фенотип напечатанных хондроцитов в 3D и формирование однородного неохряща. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать модифицированный термоструйный принтер для создания трехмерной расчетной ткани с равномерным распределением клеток в 3D-каркасе.