Методы микроинъекций уrafish-зебра (Zebrafish)

Микроинъекции эмбрионов zebrafish позволяют исследователям вводить растворы непосредственно в развивающийся организм для изучения функций генов и динамики развития. Для инъекций часто используют эмбрионы на стадии от 1 до 4 клеток. Поскольку на этом раннем этапе мембраны, разделяющие клетки и желток, отсутствуют, растворы, введенные в одну из клеток или в желток, равномерно распределятся по всему организму. С помощью микроинъекций можно экспрессировать гены продукции белков или выключать их, в зависимости от типа вводимого материала. В данном видео будут продемонстрированы подготовка пипеток, сбор эмбрионов, процедура микроинъекции, а также будут рассмотрены некоторые способы применения этого метода в современных лабораториях.

Сначала рассмотрим основные компоненты системы микроинъекций: стереомикроскоп, микроинъектор, держатель пипетки и микроманипулятор.

Микроинъектор подает точный объем жидкости посредством импульсов сжатого воздуха, параметры которых пользователь может настраивать. Держатель фиксирует пипетку для использования в ходе процедуры и соединяет ее с воздушной линией инъектора. Как правило, держатель пипетки устанавливается в микроманипулятор. Этот инструмент позволяет исследователю вносить небольшие и точные коррективы в положение пипетки во время проведения инъекции. К инъектору подключена ножная педаль, которая позволяет исследователю освободить руки, одновременно активируя импульс давления для подачи инъекционного материала. Наконец, стереомикроскоп позволяет исследователю видеть эмбрионы и фокусироваться на положении пипетки в процессе микроинъекции.

Перед началом микроинъекций необходимо подготовить стеклянные иглы. Иглы для микроинъекций должны быть одного размера для обеспечения точного введения инъекционных материалов. Использование пипетпуллера позволяет каждый раз получать тонкие и острые пипетки. Пуллер нагревает стеклянную капиллярную трубку, одновременно прикладывая силу растяжения, в результате чего образуются две иглы-пипетки.

Под микроскопом с помощью пинцета кончик иглы обрезают таким образом, чтобы обеспечить подачу постоянного объема жидкости, сохранив при этом остроту иглы для прокола эмбриона zebrafish.

Для визуализации процедуры инъекции в раствор для инъекций можно добавить феноловый красный — краситель, позволяющий отследить успешное введение вещества в эмбрион.

Иглы можно заполнить раствором для инъекций с переднего конца за счет капиллярного эффекта или заполнить с обратной стороны с помощью шприца-микролоадера. После заполнения иглы ее устанавливают в держатель для пипеток на микроманипуляторе.

Когда иглы для инъекций готовы, настраиваются параметры давления и времени микроинъектора для калибровки каждой иглы, что обеспечит введение одинакового объема вещества в каждый эмбрион. Под стереомикроскопом небольшое количество раствора вводится в каплю минерального масла на предметном стекле. Измеряется размер капли, на основании чего рассчитывается объем, подаваемый иглой. Затем давление микроинъектора корректируется, и процесс повторяется до тех пор, пока стабильно не будет получаться капля нужного размера.

После подготовки и калибровки игл извлекают эмбрионы и подготавливают их к инъекции.

Эмбрионы должны быть осторожно размещены и зафиксированы во время инъекции с помощью камеры для микроинъекций. Для создания камеры для микроинъекций в чашку Петри помещают формы, затем заливают расплавленным агарозой и дают ему затвердеть. После застывания форму извлекают и сверху наливают среду для эмбрионов. Эмбрионы можно выровнять в желобах, образовавшихся после удаления формы, используя трансфер-пипетку. В качестве альтернативы размещению эмбрионов в агарозе их можно выстроить в ряд вдоль края предметного стекла микроскопа, чтобы они располагались в один столбец для проведения микроинъекций.

После того как эмбрионы заняли нужное положение, они готовы к инъекции.

Инъекции можно проводить либо в желток, либо в цитоплазму клетки. Инъекция в желток проще и требует менее сложной техники, в то время как инъекция в цитоплазму более затруднительна, но дает более стабильные результаты. Для инъекции в желток с помощью микроманипулятора переместите иглу так, чтобы она проколола хорион, а затем желток. После этого кратковременно нажмите на педаль, чтобы содержимое иглы было вытеснено в желток. Цитоплазматический ток и диффузия обеспечивают проникновение раствора для инъекции в клетку.

Инъекция в цитоплазму требует тщательного позиционирования эмбриона для точного попадания в цитоплазму.

После инъекции эмбрионы переносят в новую чашку и инкубируют при 28.5 °C. Их регулярно проверяют для удаления погибших эмбрионов.

Для определения успешности инъекции эмбрионы могут быть проанализированы по их общему виду, по наличию флуоресцентного маркера, а также путем поиска изменений в их геноме с помощью генотипирования.

Теперь, когда вы понимаете, как проводить инъекции эмбрионам данио-рерио, давайте разберем, как ученые используют этот метод для изучения функций генов.

Во-первых, ученые могут вводить синтезированную мРНК для гиперэкспрессии определенных генов и определять их функцию путем наблюдения за фенотипом. Этот же метод может быть использован для экспрессии белков, которые визуализируют молекулярные события, такие как перестройка цитоскелета, происходящая в процессе развития.

Во-вторых, гены можно «выключать» путем инъекции морфолино. Морфолино представляют собой стабильные синтетические аналоги нуклеиновых кислот, которые могут быть сконструированы для связывания со специфическими последовательностями мРНК посредством стандартного спаривания оснований нуклеиновых кислот, что блокирует трансляцию. Это, в свою очередь, приводит к потере белка, синтезируемого данной мРНК. Такой эффект позволяет исследователям понять роль конкретного гена в развитии, наблюдая за тем, как изменяется развитие при его отсутствии.

Инъекции также могут быть использованы для введения чужеродной ДНК в организм данио-рерио. Вводя последовательности, содержащие сайты узнавания для ферментов, модифицирующих ДНК, ученые могут эффективно создавать «трансгенных» рыб с модифицированным геномом, что означает передачу чужеродных генов будущим поколениям. В зависимости от дизайна последовательности экспрессия гена может быть ограничена определенными тканями или конкретными временными точками развития.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по микроинъекциям в эмбрионы рыбки-зебра на ранних стадиях развития. В этом видео была представлена установка для микроинъекций, продемонстрирован процесс подготовки игл для микроинъекций, подготовка эмбрионов к процедуре, сама техника выполнения микроинъекций, а также некоторые области применения этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!