4.15: Техники микроинъекций рыбок данио

Микроинъекции эмбрионов рыбок данио позволяют исследователям доставлять растворы непосредственно в развивающееся животное для изучения функции генов и динамики развития. Эмбрионы от 1 до 4-клеточной стадии часто используются для инъекций. Поскольку на этой ранней стадии нет мембран, разделяющих клетки и желток, растворы, введенные либо в одну клетку, либо в желток, будут равномерно распространяться по всему организму. С помощью микроинъекции гены, производящие белок, могут быть экспрессированы или отключены, в зависимости от типа вводимого материала. В этом видео будет продемонстрирована подготовка пипетки, сбор эмбрионов, процедура микроинъекции, а также обсуждаются некоторые способы использования этой техники в лабораториях сегодня.

Во-первых, давайте рассмотрим основные компоненты системы микроинъекций: стереоскоп, микроинъектор, держатель пипетки и микроманипулятор.

Микроинъектор обеспечивает точный объем за счет импульсов давления воздуха, которые могут быть отрегулированы пользователем. Держатель пипетки фиксирует пипетку для использования во время процедуры и подключает ее к воздуховоду инжектора. Как правило, держатель пипетки помещают в микроманипулятор. Этот прибор позволяет исследователю вносить небольшие и точные корректировки в положение пипетки во время процедуры инъекции. Ножная педаль соединена с инжектором и позволяет исследователю сохранять использование своих рук, одновременно активируя импульс давления для подачи инъекционного материала. Наконец, стереоскоп позволяет исследователю видеть эмбрионы и сосредоточиться на расположении пипетки во время процедуры микроинъекции.

Прежде чем начать микроинъекцию, необходимо подготовить стеклянные иглы. Иглы для микроинъекций должны иметь одинаковый размер, чтобы обеспечить точную доставку инъекционных материалов. Съемник пипеток помогает обеспечить ежевременную подготовку тонких и острых пипеток. Съемник нагревает стеклянную капиллярную трубку, прилагая при этом усилие, которое тянет трубку, в результате чего образуются две иглы для пипетки.

Под микроскопом с помощью щипцов кончик отрезается таким образом, чтобы обеспечить постоянный объем жидкости, сохраняя при этом остроту иглы для прокалывания эмбриона данио-рерио.

Феноловый краситель, краситель, используемый для визуализации процедуры инъекции, можно смешивать с раствором для инъекции, чтобы отслеживать успешную инъекцию в эмбрион.

Иглы могут быть загружены раствором для инъекций со стороны наконечника с помощью капиллярного воздействия, или они могут быть заполнены с помощью шприца микрозагрузчика. После того, как игла загружена для инъекции, ее можно вставить в держатель пипетки на микроманипуляторе.

После того, как инъекционные иглы готовы, давление микроинъектора и настройки времени регулируются для калибровки каждой иглы, что обеспечит равномерную подачу объема каждому эмбриону. Под стереоскопом небольшое количество раствора вводится в каплю минерального масла на предметном стекле. Измеряется размер капли и можно рассчитать объем, который игла рассеивает. Впоследствии давление микроинжектора может быть дополнительно отрегулировано и процесс повторяется до тех пор, пока регулярно не будет получена капля желаемого размера.

После того, как иглы подготовлены и откалиброваны, эмбрионы получают и размещают их для инъекций.

Эмбрионы должны быть аккуратно размещены и неподвижно удерживаться во время инъекции с помощью камеры для микроинъекций. Для создания камеры микровпрыска формы помещают в чашку Петри, заливают в чашку расплавленную агарозу и дают ей застыть. Как только он застынет, форму снимают и заливают сверху среду для эмбрионов. Эмбрионы могут быть выстроены в корыта, которые были созданы пресс-формой с помощью трансферной пипетки. Одной из альтернатив расположению эмбрионов в агарозе является выстраивание их вдоль края предметного стекла микроскопа, чтобы они располагались в колонке для микроинъекций

Как только эмбрионы находятся в нужном положении, они готовы к инъекции.

Эмбрионы могут вводиться либо в желток, либо в цитоплазму клеток. Инъекция в желток более проста и требует менее сложной техники инъекции, в то время как инъекция в цитоплазму более сложна, но дает более устойчивые результаты. Чтобы ввести в желток, с помощью микроманипулятора переместите иглу так, чтобы она проколола хорион, а затем желток. Затем нажимают на ножную педаль, чтобы содержимое иглы превратилось в желток. Цитоплазматический поток и диффузия позволяют инъекционному раствору поступать в клетку.

Инъекция в цитоплазму требует тщательного позиционирования эмбриона, чтобы цитоплазму можно было эффективно воздействовать.

После инъекции эмбрионы перекладываются в новую чашку и инкубируются при температуре 28,5 °C. Их часто проверяют на предмет удаления мертвых эмбрионов.

Чтобы определить успешность инъекции, эмбрионы могут быть проанализированы на основе их общего внешнего вида, наличия флуоресцентного маркера, а также путем поиска изменений в их геноме с помощью генотипирования.

Теперь, когда вы понимаете, как вводить эмбрионы рыбок данио, давайте рассмотрим, как ученые могут использовать этот метод для понимания функции генов.

Во-первых, ученые могут вводить синтезированную мРНК для сверхэкспрессии определенных генов и определять их функцию, наблюдая за фенотипом. Этот же метод может быть использован для экспрессии белков, которые выделяют молекулярные события, такие как перестройки цитоскелета, происходящие во время развития.

Во-вторых, гены могут быть выключены путем инъекции морфолиноса. Морфолино являются стабильными синтетическими аналогами нуклеиновых кислот, которые могут быть сконструированы для связывания с определенными последовательностями мРНК путем стандартного спаривания оснований нуклеиновых кислот и блочной трансляции. В свою очередь, это приводит к потере белка, производимого этой мРНК. Этот эффект позволяет исследователям понять роль конкретного гена в развитии, наблюдая, как развитие изменяется в его отсутствие.

Инъекция может быть использована для включения чужеродной ДНК в данио-рерио. Вводя последовательности, содержащие сайты узнавания для ферментов, модифицирующих ДНК, ученые могут эффективно создавать «трансгенных» рыб с модифицированными геномами, а это означает, что чужеродные гены будут переданы будущим поколениям. В зависимости от дизайна последовательности, экспрессия генов может быть ограничена конкретными тканями или определенными временными точками развития.

Вы только что посмотрели представление JoVE о микроинъекциях ранних эмбрионов рыбок данио. В этом видео была представлена настройка микроинъекций, продемонстрировано, как подготовить иглы для микроинъекций, показано, как подготовить эмбрионы к микроинъекции, выполнить технику микроинъекции и некоторые области применения микроинъекций. Как всегда, спасибо за просмотр!