Использование этикеток без оптические биосенсоры для обнаружения модуляции калиевых каналов на G-белком рецепторов

Общая цель следующего эксперимента заключается в выявлении модуляции G-белоксопряженных рецепторов калийными каналами с использованием безмаркерных оптических биосенсоров на основе градиента резонансной длины волны. Для достижения этой цели клетки HEK 2 93 и клетки HEK 2 93, стабильно экспрессирующие натрий-активируемый калиевый канал крысы slack B, высевают в 384-луночный планшет с оптическими биосенсорами и инкубируют в течение ночи. Затем проводится базовое измерение массы вблизи плазматической мембраны и добавляются агонисты эндогенных G-белоксопряженных рецепторов (GPCR). На заключительном этапе измеряют изменение сигнала, вызванное активацией GPCR, и рассчитывают модуляцию этого ответа калийным каналом.

В конечном итоге этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии и клеточной сигнализации путем количественного измерения механизмов передачи сигнала между G-белоксопряженными рецепторами и калиевыми каналами. Основными преимуществами использования данной методики по сравнению с существующими методами изучения взаимодействий между каналами и белками, такими как, например, ко-иммунопреципитация и осадочные тесты, является возможность проведения анализа на живых клетках. Она не требует использования экзогенных меток, которые могли бы изменить структуру взаимодействующего белка.

И, наконец, внутри живых клеток можно отслеживать взаимодействия в режиме реального времени. Хотя этот метод позволяет получить представление о передаче сигналов между GPCR и калиевыми каналами, его также можно использовать для изучения клеточных ответов, возникающих в результате индуцированных лигандом изменений адгезии и распластывания клеток, токсичности, пролиферации, миграции, а также любых изменений расстояния от плазматической мембраны до оптического биосенсора.

Данный метод также обладает потенциалом для поиска новых терапевтических подходов к лечению заболеваний, вызванных нарушениями ионных каналов или рецепторов, таких как многие каналопатии, поскольку он может быть использован в качестве высокопроизводительного метода тестирования влияния фармакологических агентов на белки каналов. Взаимодействия белков. Идея использовать этот метод возникла у нас, когда мы осознали необходимость разработки анализа, позволяющего изучать взаимодействия белков каналов в живых клетках.

Начните покрытие 384-луночного планшета для оптических биосенсоров с гидратацией планшета из диоксида титана, добавив по 20 µL стерильной воды для культур тканей в каждую лунку на 15 минут. Затем с помощью 16-канального дозатора однократно промойте планшет, добавив по 50 µL фосфатно-солевого буфера (PBS) в каждую лунку.

Затем добавьте по 20 µL приготовленного рабочего раствора фибронектина в каждую лунку, после чего инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре для создания внеклеточного матрикса (ECM). Промойте планшет один раз, используя по 50 µL PBS на лунку, затем добавьте в каждую по 40 µL приготовленного рабочего раствора овальбумина.

Инкубируйте планшет в течение ночи при 4 °C для блокировки поверхности после связывания овальбумина. Промойте планшет трижды, используя по 50 µL PBS на лунку. Планшеты, покрытые ECM, можно хранить при 4 °C до 48 часов.

Удалите ростовую среду из клеток HEK 2 93 без резекции и клеток HEK 2 93 со стабильной экспрессией slack B, которые культивировали согласно текстовому протоколу. Затем добавьте трипсин, чтобы открепить клетки от поверхности планшета. Соберите клетки путем центрифугирования при 1000 ×g в течение одной минуты.

Удалите среду с трипсином и ресуспендируйте клетки в ростовой среде. Используя гемоцитометр или автоматический счетчик клеток, определите концентрацию клеток; чтобы минимизировать эффекты испарения во время инкубации, разведите клетки до достижения необходимого их количества на лунку. Для данных экспериментов в объеме 50 µL ростовой среды это 1000 клеток на лунку.

Клетки высевали на биосенсор, добавляя по 50 µL разведенной клеточной суспензии в каждую лунку; после этого осевшие клетки инкубировали в ростовой среде в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. Для подготовки анализа на оптическом биосенсоре с градиентом резонансной длины волны (RWG) удалите ростовую среду из лунок с клетками после завершения инкубации.

Однократно промойте клетки сбалансированным солевым раствором Хэнкса, затем добавьте по 25 µL раствора в каждую лунку. Поместите планшет с биосенсорами в сканер для связывания и дайте клеткам уравновеситься при комнатной температуре в течение одного-двух часов. Тем временем подготовьте отдельный планшет с соединениями, из которого в ходе анализа будут добавляться интересующие лиганды в планшет с биосенсорами.

Для этих анализов в каждую лунку планшета биосенсора добавляли по 25 мкл раствора, содержащего соединение, до достижения общего объема 50 мкл. Для проведения анализа с помощью оптического биосенсора RWG выполните измерение базовой линии с помощью системы сканирования для лунок с A1 по P12, которые составляют половину 384-луночного планшета; используйте максимальное разрешение 3,75 мкм на пиксель для центральных 1,5 мм каждой лунки с помощью программного обеспечения Bind Scan; это базовое сканирование займет примерно 30 минут.

Затем добавьте по 25 µL растворов соединений в каждую лунку с A 1 по P 12. Далее проведите базовое измерение в лунках с A 13 по P 24. После определения базового уровня в этих лунках добавьте по 25 µL растворов соединений в каждую из лунок с A 13 по P 24.

В качестве завершающего этапа проведите измерение после добавления соединения для лунок с A1 по P12, а затем повторите процедуру для лунок с A13 по P24. Чтобы проанализировать данные анализа, откройте данные bind assay для базового измерения в окнах и нажмите кнопку редактора сетки (grid editor), чтобы включить выбор ячеек. Программное обеспечение рассчитает интересующие пользователя показатели; откройте плагины, включая инструмент поиска ячеек (cell finder), и установите параметры базовой линии или функции в cell finder таким образом, чтобы ячейки были отличимы от фона биосенсора.

Экспортируйте файл карты клеток, который содержит данные поиска клеток для базового измерения. Повторите эти шаги для данных после добавления соединения. Затем откройте базовое измерение или плагин и импортируйте карту клеток из базового измерения.

Программное обеспечение рассчитает сдвиг значения пиковой длины волны (PWV) между фоновыми данными и данными после добавления соединения. Для получения среднего сдвига PWV для клеток выберите параметр delta cell mean. Затем данные можно экспортировать в Microsoft Excel для дальнейшего анализа.

Стабильно трансфектированные клетки HEK 293, экспрессирующие Slack b, и контрольные нетрасфектированные клетки HEK 293 высевали в количестве 1000 клеток на лунку в 384-луночные биосенсорные планшеты RWG с ECM-покрытием; карты градиента плотности массы были получены с помощью bind-сканирования до добавления соединения и через 30 минут после него.

Области программного обеспечения, выделенные красным цветом, представляют собой пиксели, идентифицированные как принадлежащие клеткам, а желтые линии отделяют клетки от серого фона планшета. Программное обеспечение bind view использовалось для определения сдвига PWV после добавления агониста GPCR путем вычитания значения PWV после добавления соединения из базового значения PWV. Это отображается цветовым градиентом, где красный цвет соответствует положительному сдвигу значения пиковой длины волны, а синий — отсутствию изменений.

Эндогенный мускаретный рецептор M1 в ответ на карбахол был исследован как в контрольных нетрансфицированных клетках HEK 2 93, так и в клетках HEK 2 93 со стабильной экспрессией slack B, что привело к положительному увеличению значения пиковой длины волны по сравнению с контрольными клетками. В клетках, трансфицированных slack B, наблюдалось более выраженное увеличение значения пиковой длины волны. S-F-L-L-R NH two, трифторацетат, и C-концевой тромбин-активирующий пептид — пентапептид, проявляющий агонистическую активность в отношении эндогенного GPCR протеаз-активируемого рецептора один, — также продемонстрировали различные ответы в нетрансфицированных клетках и клетках, трансфицированных slack B.

Эти результаты показывают, что наличие канала Slack B значительно увеличивает сдвиг PWV, который возникает при активации эндогенного G PCR в клетках he K, и демонстрируют возможность использования этого анализа для изучения взаимодействий белков каналов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как разрабатывать и проводить анализ с использованием безмаркерного оптического биосенсора. После освоения эту технику можно выполнять в течение двух дней, если клетки и реагенты были тщательно подготовлены в процессе выполнения данной процедуры.

Важно помнить, что параметры анализа, такие как количество высеваемых клеток, время инкубации лигандов и так далее, должны быть оптимизированы для различных клеточных линий. После выполнения данной процедуры вы можете использовать другие методы, такие как статистический анализ в R и искусственный интеллект, чтобы попытаться определить, какие именно белки необходимы для наблюдаемого изменения сигнала. Не забывайте, что работа с культурами клеток человека может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, например, работать в боксе биологической безопасности.