Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке связывания коротких пептидов с двумя иммунными белками MHC человека с использованием высокопроизводительного анализа на 3 84 лунках. Это достигается путем первого проведения анализов конкуренцию связывания фазы раствора с представляющими интерес пептидами. На втором этапе уравновешенные комплексы пептида MHC two захватывают антителом против MHC two, иммобилизованным на планшетах ELIZA с высокой связываемостью.

Затем захваченные комплексы инкубируются с опиумом, меченным стрептавидином, а затем несвязанный стрептавидин смывается и захваченный опиум активируется. В конечном счете, флуориметрия с временным разрешением может быть использована для количественной оценки уровней двух захваченных контрольных пептидов MHC. Этот метод может дать предварительное представление об иммуногенном потенциале белков-мишеней.

Это особенно полезно для валидации выхода предикторов in silico, Начните процедуру с добавления 25 микролитров свежеразведенного раствора антитела L 2 43 в каждую лунку 3 84. Хорошо переплетается белая пластина ELIZA с высоким связыванием и запечатывается полиэфирной пленкой и инкубируется в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Затем начните с 10 миллимолярного запаса каждого теста.

Пептид и ДМСО образуют следующий ряд разбавлений и цитратфосфатный буфер с использованием 3 84-луночных полипропиленовых пластин. Обратите внимание, что для полной полипропиленовой пластины на 3 84 лунки требуются три отдельные пластины EIA, как показано на рисунке. Затем разбавьте выбранные два стоковых раствора MHC до 101 наномолярной концентрации в реакционном буфере с помощью конической пробирки объемом 15 миллилитров.

Затем разведите контрольный пептид с 20 мкмоль в соотношении один к 100 в свежеприготовленной смеси MHC two master mix и добавьте 21,5 мкл смеси MHC two master с контрольным пептидом до положительного контроля. Из полипропиленовой пластины с 3 84 лунками добавьте смесь MHC с двумя мастерами, содержащую контрольный пептид, к каждому из тестовых пептидных разведений в соотношении один к одному, чтобы создать реакцию связывания и в это время. Наконец, запечатайте реакцию связывания полиэфирной пленкой и инкубируйте планшет в течение 12-24 часов в инкубаторе без контроля содержания углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания.

На следующий день разбавьте реакцию связывания лунками в 3:84. Луночный планшет в соотношении один к одному с нейтрализующим буфером. Затем промывайте планшет Элизы три раза по 60 микролитров на лунку PBS 0,05% между следующим переносом 25 микролитров каждого нейтрализованного раствора реакции связывания с планшетом 3 84 в трех экземплярах с покрытием из антител 3 84.

Ну, Элиза планшет затем инкубируют на планшете ELIZA, покрытом полиэфирной пленкой, при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи после инкубации. Вымойте пластину ELIZA три раза, как только что продемонстрировано, а затем добавьте в каждую по 25 микролитров свежеразведенного стрептококка дина опиума. Хорошо инкубируйте тарелку, накрытую полиэфирной пленкой, в темноте при комнатной температуре в течение одного часа.

Во время инкубации доведите 10 миллилитров раствора для улучшения на каждую пластину до комнатной температуры также в темноте через один час, вымойте планшет ELIZA, как показано на рисунке, а затем добавьте по 25 микролитров раствора для улучшения в каждую лунку и инкубируйте планшет, накрытый полиэфирной пленкой, в течение 10-15 минут в темноте. Наконец, считайте флуоресценцию с помощью считывателя флуоресцентных пластин с временным разрешением и настройками опиума. В этом репрезентативном эксперименте зрелая пептидная последовательность энтеробактер Cloe P nine nine бета-лактамазы была проанализирована на предмет предполагаемых пептидных связывающих аллель MHC two.

DRB один, пятнадцать или сто семнадцать нон, или пептидов были идентифицированы с обязательным остатком P один якорь в первой позиции, который требуется для связывания MHC 2 при 5%-ном пороге. Пептиды с баллами больше или равными 2,6, вероятно, являются связывающими. Таким образом, при пороге в 5% только верхние 11 пептидов, согласно прогнозам, связываются с MHC 2 DRB 1 15 0 1.

Репрезентативная панель предсказанных эпитопов была выбрана для анализа в этом анализе связывания MHC с двумя связываниями. Фрагменты бета-лактамазного пептида этих 15 остатков были химически синтезированы таким образом, что предполагаемые нонамеры MHC два эпитопа были встроены в их синтетические белковые фрагменты. Способность этих синтетических пептидов конкурировать с биотинилированным миелиновым основным пептидом белка B для связывания с MHC 2 DRB 1 15 0 1 была проанализирована, как показано выше.

Конкурентные кривые связывания для синтетических пептидов проиллюстрированы здесь. Значения IC 50 были рассчитаны путем аппроксимации данных логарифмического преобразования с использованием нелинейной аппроксимированной функции привязки одного сайта. Как показано в таблице, как видно на графике, пептиды естественным образом разделены на три группы: сильные связывающие с IC 50 менее одного микромоля, умеренные связывающие с IC 50 больше или равные одному микромоляру, но менее 100 микромоляров, и слабые связывающие с IC 50 больше или равные 100 микромолярам после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области молекулярной иммунологии и биотерапевтического дизайна к более полному изучению ключевых событий молекулярного узнавания, лежащих в основе антибелковых иммунных реакций у пациентов.