Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

Общая цель данной процедуры заключается в количественном определении связывания коротких пептидов с иммунными белками MHC II человека с помощью высокопроизводительного анализа в 384-луночном планшете. Это достигается путем предварительного проведения анализов конкурентного связывания в жидкой фазе с интересующими пептидами. На втором этапе уравновешенные комплексы пептид-MHC II захватываются с помощью антител к MHC II, иммобилизованных на планшетах для ИФА с высокой сорбционной способностью.

Затем захваченные комплексы инкубируют со стрептавидином, меченным опиумом, после чего несвязавшийся стрептавидин отмывают, а захваченный опиум активируют. В конечном итоге для количественного определения уровней MHC two захваченного контрольного пептида можно использовать флуориметрию с временным разрешением. Данный метод позволяет получить предварительные сведения об иммуногенном потенциале целевых белков.

Этот метод особенно полезен для валидации результатов прогнозирования in silico. Начните процедуру, добавив по 25 µL свежеразведенного раствора антител L 2 43 в каждую лунку белого высокосвязывающего 384-луночного планшета для ИФА; загерметизируйте планшет полиэстеровой пленкой и инкубируйте его в течение ночи при 4 °C. Затем, используя 10 мМ стоковые растворы каждого исследуемого вещества.

Приготовьте следующую серию разведений пептида и DMSO, а также цитрат-фосфатный буфер, используя три полипропиленовых 84-луночных планшета. Обратите внимание, что один полный 84-луночный полипропиленовый планшет требует использования трех отдельных планшетов для ИФА, как показано на иллюстрации. Затем разведите выбранные стоковые растворы MHC II до концентрации 101 нМ в реакционном буфере, используя коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем разведите контрольный пептид из 20 micromolar в соотношении 1:100 в свежеприготовленном мастер-миксе MHC two и добавьте 21,5 microliters мастер-микса MHC two с контрольным пептидом в лунку положительного контроля 384-луночного полипропиленового планшета. Добавьте мастер-микс MHC two, содержащий контрольный пептид, в каждое разведение тестового пептида в соотношении 1:1, чтобы также инициировать реакцию связывания. В завершение запечатайте реакцию связывания полиэфирной пленкой и инкубируйте планшет от 12 до 24 часов в инкубаторе без контроля содержания carbon dioxide при 37 degrees Celsius без встряхивания.

На следующий день разбавьте содержимое лунок с реакцией связывания в 384-луночном планшете нейтрализующим буфером в соотношении один к одному. Затем трижды промойте планшет для ИФА, используя 60 µL 0,05% PBS на лунку. После этого перенесите по 25 µL каждого нейтрализованного раствора реакции связывания из 384-луночного планшета в трипликатах в 384-луночный планшет, покрытый антителами.

Заполните лунки планшета для ИФА, затем инкубируйте планшет для ИФА, покрытый полиэстеровой пленкой, при 4 °C в течение ночи. После инкубации промойте планшет для ИФА трижды, как было продемонстрировано, а затем добавьте по 25 µL свежеразведенного стрептавидина с биотином в каждую лунку. Инкубируйте планшет, покрытый полиэстеровой пленкой, в темноте при комнатной температуре в течение одного часа.

Во время инкубации доведите 10 миллилитров раствора усиления на планшет до комнатной температуры также в темноте; через один час промойте планшет для ELISA, как показано в инструкции, затем добавьте по 25 µL раствора усиления в каждую лунку и инкубируйте планшет, накрыв его полиэфирной пленкой, в течение 10–15 минут в темноте. В завершение измерьте флуоресценцию с помощью планшетного ридера для флуоресцентного анализа с временным разрешением с соответствующими настройками. В данном репрезентативном эксперименте зрелая пептидная последовательность бета-лактамазы enterobacter Cloe P 99 была проанализирована на наличие предполагаемых пептидных связующих с аллелем MHC II.

Были идентифицированы пептиды DRB1*15:01, содержащие обязательный якорный остаток P1 в первой позиции, который необходим для связывания с MHC II, только при пороге 5%. Пептиды со значениями, равными или превышающими 2,6, вероятно, являются связующими. Таким образом, только при пороге 5% прогнозируется связывание с MHC II DRB1*15:01 для 11 лучших пептидов.

Для проведения данного анализа связывания с MHC II был выбран репрезентативный набор прогнозируемых эпитопов. Фрагменты пептидов бета-лактамазы длиной 15 остатков были синтезированы химическим путем таким образом, чтобы предполагаемые нонамерные эпитопы MHC II были встроены в эти синтетические белковые фрагменты. Затем, как было продемонстрировано выше, анализировали способность этих синтетических пептидов конкурировать за связывание с MHC II DRB 1 15 0 1 с контрольным биотинилированным пептидом основного белка миелина B.

Здесь представлены кривые конкурентного связывания для синтетических пептидов. Значения IC 50 были рассчитаны путем аппроксимации логарифмически преобразованных данных с использованием функции нелинейной регрессии для конкурентного связывания с одним сайтом в программе Prism. Как показано в таблице и на графике, пептиды естественным образом разделились на три группы: сильные связывающие агенты со значением IC 50 менее 1 µM, умеренные связывающие агенты со значением IC 50 от 1 µM до 100 µM и слабые связывающие агенты со значением IC 50 100 µM и более после завершения разработки.

Данный метод открыл исследователям в области молекулярной иммунологии и разработки биотерапевтических препаратов возможность более полно изучить ключевые события молекулярного распознавания, лежащие в основе иммунных ответов на белки у людей.