Трехмерные культуры: инструмента для изучения Normal Acinar Архитектура против злокачественной трансформации клеток молочной железы

Общая цель этой процедуры заключается в использовании трехмерной системы культивирования в качестве средства отличия доброкачественного фенотипа молочной железы от злокачественного фенотипа молочной железы. Это достигается путем предварительного гальванического покрытия контрольных и экспериментальных клеток в трех экземплярах на слое уменьшенного фактора роста матригеля в предметном стекле с восемью лунками. Второй шаг заключается в том, чтобы давать свежие полные изменения среды с помощью 2% GFR Matrigel каждый четвертый день, позволяя исининоподобным колониям расти в течение 10-15 дней.

Затем фазово-контрастные изображения азероподобных колоний, выращенных в 3D, получаются с пятикратным разрешением. Заключительным этапом является обработка азероподобных культур для иммуноцитохимического анализа соответствующими молекулярными маркерами с последующим получением конфокальных изображений в С-двух иммуно-красильных азероподобных колоний в средней части. В конечном счете, фазовый контраст и конфокальные изображения клеток, выращенных в 3D-культуре, используются для идентификации клеточных фенотипических и молекулярных изменений и, таким образом, дифференцируют доброкачественные клетки молочной железы от злокачественных.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как двумерные культуры, анализы инвазии или миграции, заключается в том, что он может повторить тканевую архитектуру доброкачественной молочной железы и потерю ее организации во время злокачественной трансформации. Таким образом, этот метод может быть эффективно использован для дифференциации доброкачественных клеток молочной железы от злокачественных клеток молочной железы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака молочной железы, такие как дефект сигнальных путей в клеточном фенотипе, а также в выявлении новых онкогенных путей и/или путей супрессора опухолей.

Для начала эксперимента разморозьте уменьшенный фактор роста или матригел СКФ при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Затем нагрейте весь фильтрующий материал HME до 37 градусов Цельсия и поместите предметное стекло с восемью лунками на лед для охлаждения. Добавьте 40 микролитров GFR Matrigel в центр каждой лунки предварительно охлажденного предметного стекла.

Распределите гель как можно более равномерно с помощью наконечника пипетки P 200, избегая образования пузырьков и чрезмерного растекания, которые могут привести к образованию мениска. Затем затвердейте гель matri, инкубируя предметное стекло при 37 градусах Цельсия и 5% CO2, в то время как гель matri затвердевает трипсин глаз, клетки HME, затем соберите их в 15-миллилитровую пробирку и вращайте клетки со скоростью, в 150 раз превышающей силу тяжести, в течение четырех минут, подсчитайте клетки и разбавьте их до 12 500 клеток на миллилитр. В готовых средах добавьте матригель СКФ в клеточную суспензию в конечную концентрацию 2% и добавьте по 400 микролитров раствора в каждую лунку предварительно закодированной камеры Slide.

Затем поместите предметное стекло в буферный инкубатор с CO2. Заменяйте фильтрующий материал на свежий готовый каждые четыре дня в течение 15 дней. Для исследований ингибиторов добавляйте низкомолекулярные ингибиторы в полную среду во время нанесения покрытия, после чего следует смена свежей среды, дополненная ингибиторами каждые три дня, чтобы начать рост клеток, и утроение для каждого набора процедур.

Сделайте фазово-контрастные изображения азерных структур из каждой лунки с пятикратным разрешением с помощью фазово-контрастного микроскопа, прикрепленного к ползунку слайдов и компьютеру. Делайте снимки, перемещая предметное стекло из одной рамки в другую, охватывая всю ячейку камерного предметного стекла по ширине. Подсчитайте общее количество структур aser, количество одиночных круглых плоских структур и количество многоуровневых структур или беспорядочно растущих структур, которым не хватает организации.

А с помощью исходящих процессов ветвления рассчитайте процентное соотношение одиночных круглых плоских структур по сравнению со злокачественными структурами и нанесите информацию на график. В виде столбчатого графика. Рассчитайте значение с помощью Т-критерия двустороннего непарного студента.

Подготовьте реагенты для иммунофлюоресцентного окрашивания, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем с помощью пипетки P 200 осторожно отсасывайте кондиционированную среду. Затем зафиксируйте АСИН или структуры свежеприготовленным 2%параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут после фиксации, пропитайте клетки 0,5%-ным триттоном Х 100 в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем трижды промыть культуры 100 миллиметровым глицином в течение 10 – 15 минут для каждой промывки. Затем заблокируйте ячейки в первичном буфере блока на один час при комнатной температуре. Затем инкубируйте культуры в концентрации 20 микрограммов на миллилитр козьего антимышиного fab two фрагмента в первичном блок-буфере, также называемом вторым блокирующим раствором, в течение 30 минут для блокирования аминореагирующих мышиных видов IgG в матригеле.

После блокирования инкубируйте клетки с первичным антителом во втором блокирующем растворе в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Промойте клетки трижды иммунофлуоресцентным буфером или I буфером с легким покачиванием в течение 10-15 минут для каждого промывки. Затем инкубируйте клетки с флуоресцентными конъюгированными вторичными антителами в буфере if F в течение 45 минут.

Далее промойте ячейки три раза по 10 минут каждая с помощью буфера if F и мягкого покачивания. Установите предметные стекла с DPI, содержащим реагент против выцветания, чтобы визуализировать ядра. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.

Затем получите конфокальные изображения в средней части колонии, растущих на вершине матрицы, и серию оптических срезов по всей длине структуры Аснера путем z-наложения конфокальных изображений DPI, окрашенных HME, контролируемых и C CN шести нокдаунов, на пятый день показывают, что нокдаунам не хватает организации. На 15-й день контрольные клетки останавливаются в росте с дифференцированными ASIN или структурами и четко выраженным просветом, расходящимися от нокдауновых клеток, которые демонстрируют инвазивный ветвящийся и канальцевый фенотип. Иммунофлуоресцентное окрашивание показывает потерю экспрессии ламинина v альфа-шести интегрина и геррина ЭХА, что указывает на нарушение базальной мембраны, потерю базальной полярности и контакта с клетками соответственно.

В злокачественных клетках контрольные клетки демонстрируют интактный слой вокруг азининовой базальной экспрессии альфа-шести интегринов, апикальной экспрессии GM one 30 и eca. Здесь, на стыке клеточных клеток, злокачественный фенотип CCN шести нокдаун-клеток HME был обращен вспять с помощью экзогенной обработки очищенного рекомбинантного человеческого белка CCN шести двух высокометастатических линий клеток молочной железы, some 1 49 и M-D-A-M-B 2 31. Лечились ингибиторами map-киназы P 38, SB 2 0 3 8 50 и SB 2 0 2 1 90, что снижало злокачественное поведение.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выращивать клетки молочной железы в 3D-культуре и эффективно использовать синоподобный рост на matrigel в качестве считывания для дифференциации фенотипов доброкачественных и злокачественных клеток молочной железы.