Неонатальный пиальных поверхности Электропорацию

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы генетически маркировать и манипулировать нейральными предшественниками поверхности кожуры. Это достигается путем введения сначала стеклянной пипетки, заполненной раствором плазменной ДНК, в область поверхности пилинга. Второй шаг заключается во введении ДНК в менингеальное пространство, расположенное над поверхностью кожуры.

Далее электроды ориентируются таким образом, чтобы правильно подавать ток на поверхность кожуры. Заключительный этап заключается в том, что ДНК электропорируется в предшественники поверхности кожуры с помощью тока. В конечном счете, этот метод может быть объединен с другими методами, чтобы показать естественную историю и молекулярные детерминанты поверхности кожуры, пролиферации нервных предшественников, миграции и/или дифференцировки.

Основные преимущества этой методики перед существующими методами, такими как вирусная трансдукция, заключаются в том, что электропорация более безопасна, гибка и не требует создания вирусных частиц или упаковки. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, например, каков вклад этих предшественников поверхности кожуры в ткань, гистогенез и функцию нейронных цепей. Для начала с помощью съемника пипеток формируйте пипетки из стеклянных капиллярных трубок, после чего вытащите кончик острыми ножницами.

Затем приготовьте 1%-ный раствор для быстрого зеленого материала, используя отфильтрованную воду, не содержащую нуклеазы. После разведения эндотоксина свободной плазменной ДНК ДНК представляет интерес к буферу ЭДТА, соедините его в соответствующих пропорциях до 1%-ного быстрого зеленого раствора. С помощью стандартной пипетки поместите нужное количество плазмидной смеси, которая будет введена, на кусок парафиновой пленки для справки.

Далее, с помощью микроинжектора, осторожно вставьте собранную стеклянную пипетку в пробирку, содержащую плазмидную смесь. Избегайте прикосновения наконечника к краям трубки, чтобы не сломаться. Отсасывайте раствор в пипетку, медленно поворачивая ручку переноса назад.

После того, как будет загружен достаточный объем, подавайте вперед до тех пор, пока давление не вернется к нейтральному положению нуля. Гектор Паскаль. Затем поместите наконечник рядом с эталонным впрыском и используйте ножную педаль микроинжектора для выброса одного объема.

Регулируйте давление до тех пор, пока его количество не сравняется с ранее набранным контрольным объемом. После калибровки объема инъекции извлеките животных для инъекции плазмиды. Как только глубина анестезии будет подтверждена, удерживайте щенка большим и указательным пальцами менее доминирующей руки.

Используйте доминирующую руку для нацеливания на нужную область, корковые полушария и другие поверхностные структуры, такие как верхние колликулы, должны быть хорошо видны. После того, как будет определено правильное местоположение, введите пипетку мимо кожи и черепа. Старайтесь избегать мозговых артерий.

Чтобы нацелиться на поверхность пилинга, немедленно прекратите продвижение пипетки Как только череп будет пробит наконечником пипетки в правильном положении, введите плазмидный раствор с помощью ножной педали микроинъектора После инъекции осторожно извлеките пипетку. Предотвратите высыхание и засорение наконечника между инъекциями, поместив его в тестовые капли, расположенные на парафиновой пленке. Повторяйте эти действия до тех пор, пока все щенки не будут введены инъекции, чтобы увеличить проводимость и предотвратить ожог кожи.

Покройте трехмиллиметровый платиновый пинцет TRO гелем для электропорации. Далее отрегулируйте настройки электро для инъекций в кору головного мозга. Поместите отрицательно заряженный зонд над областью инъекции, а положительно заряженный зонд — вокруг контралатеральной области под глазом.

Ориентация электродов должна быть под углом от 45 до 60 градусов относительно средней линии. Используйте ножную педаль для запуска тока и удерживайте TRO пинцета на месте в течение трех-пяти импульсов. В зависимости от возраста и веса щенка, импульсы должны быть нацелены на ДНК в клетки поверхности кожуры.

Отрицательный полюс может быть протянут над областью инъекции. Между импульсами или большим электродом можно использовать для увеличения электрозоны сразу после электропорации, тщательно очистите гель от детенышей и поместите их под тепловую лампу примерно на пять минут. Щенки будут резко терять свой естественный красноватый розовый цвет в течение нескольких минут после электропорации из-за цианоза.

Наблюдайте за щенками на предмет восстановления естественного цвета и начала нормального движения, прежде чем возвращать их в клетки или делать инъекции в верхний колус. Расположите целевую область сразу за и латеральнее лямбды и примерно по средней линии, выполнив те же шаги, что и выше. При успешных инъекциях плазмидная смесь естественным образом заполняет контуры верхнего колуса.

При электроработе после инъекций верхнего колуса отрицательно заряженный зонд электрода помещается на область инъекции, а положительно заряженный зонд — вокруг глаза, морды или подбородка. В этом случае ориентация электрода находится под углом от 25 до 40 градусов относительно средней линии. На этом изображении показана дорсальная латеральная кора после электропорации флуоресцентных репортерных плазмид, экспрессирующих мембрану, помеченную зеленым цветом и помеченную bfp.

Два ядерных белка показаны здесь красным псевдоцветом. Обширные дендриты обнаруживаются в этом корковом интернейроне примерно через два месяца после электропорации. EGFP-положительные клетки являются BRDU-положительными, что указывает на то, что они пролиферировали во время процедуры электропорации.

При использовании этой техники важно сосредоточиться на правильном нацеливании на поверхность пилинга, чтобы избежать нарушения работы нижележащей коры и/или сосудистой системы.