Тканевая инженерия из стромальных опухолей микроокружения с применением к клеточной Рак Invasion

Общей целью следующей процедуры является создание нативного матрикса из фибробластов для оценки инвазии опухолевых клеток. Это достигается сначала путем выращивания фибробластов на пластике в среде, обогащенной сорбиновой кислотой, для создания нативной матрицы. На втором этапе нативная матрица отделяется и освобождается от пластиковой поверхности выращивания, а затем эта матрица засевается опухолевыми клетками и поднимается на границу раздела воздушной жидкости через фиксированный период.

Эти 3D-культуры собираются для гистологического анализа инвазии опухолевых клеток. В конечном счете, влияние нативного матрикса фибробластов на инвазию опухолевых клеток может быть оценено с помощью иммуногистологического анализа. Таким образом, преимущество этого метода для получения 3D-типических культур заключается в том, что мы можем оценить нативный матрикс, производимый самими фибробластами, в отсутствие синтетических или чужеродных субстратов, таких как кросс-видовой коллаген первого типа.

Два фосфата выводят из клеток каждые два-три дня с двумя-пятью миллилитрами свежей среды. Толстый слой клеток, встроенный во внеклеточный матрикс, видимый невооруженным глазом, образуется в конце шести недель. В зависимости от используемых клеток, видимая матрица может образоваться рано или поздно и начать отделяться от чашки, как показано на рисунке.

Чтобы освободить этот слой от планшета для культуры тканей, аккуратно соскребите окружность матрицы с помощью наконечника микропипетки объемом в один миллилитр, а затем прижмите края матрицы к центру лунки. Ячейки и нативная матрица должны легко отделяться от поверхности пластины и теперь плавать в среде. Распределите нативную матрицу внутри носителя, чтобы избежать ее сворачивания.

Дайте родной матрице плавать и переделывать в течение пяти дней, продолжая менять среду каждые два-три дня из-за прочности на разрыв и внутреннего ремоделирования. Матрица резко сократится и превратится в меньшую, но более толстую нативную матрицу, после чего она будет готова к использованию. Для инвазионного анализа.

Для инвазионного анализа. Сначала с помощью тупых щипцов аккуратно перенесите родную матрицу на капроновую сетку. Оказавшись в сети, используйте наконечник микропипетки объемом один миллилитр и тупые щипцы, чтобы аккуратно раздвинуть матрицу, чтобы она лежала как можно ровнее.

Затем нанесите небольшое количество вазелина на один конец одного стерильного клонального цилиндра на матрицу. Затем поместите цилиндры на нативные матрицы вазелиновой стороной вниз, чтобы обеспечить плотное прилегание между нативной матрицей и клональными кольцами. Теперь добавьте в цилиндры 250 000 клеток плоскоклеточной карциномы кожи или клеток ПКК в питательной среде каратного сайта.

После того, как кожные клетки SCC осядут на нативную матрицу, удалите цилиндры, затем поднимите нативную матрицу нейлоновой сетки и кожные клетки SEC на границу раздела воздушной жидкости и на изогнутую опору из проволочной сетки из нержавеющей стали. Наконец, добавьте питательную среду кератиноцитов, дополненную сорбиновой кислотой до тех пор, пока уровень среды не коснется дна нативного матрикса, меняя среду каждые два-три дня и собирая через семь и 14 дней после посева клеток кожных ПКК. Этот метод открывает возможность изучения и сравнения инвазивного поведения опухолевых клеток в различных трехмерных стромальных средах.

Как видно на этих изображениях, инвазия кожных кератиноцитов ПКК RDEB была значительно замедлена в C 7 по сравнению с экспрессирующими нативными матрицами в правых панелях по сравнению с контрольной группой C с дефицитом RDEB в левой панели. Разработка этого метода позволила исследователям непосредственно оценить влияние нативного матрикса, производимого фибробластами, на процессы в опухолевых клетках, такие как инвазия.