Реконструкция 3-Dimensional гистологии Том и его применение для изучения Mouse молочных желез
26 июля 2014 г.
Мы представляем подход к регистрации изображений для трехмерной (3D) объемной реконструкции гистологии, который облегчает изучение изменений органа на уровне макроструктур, состоящих из клеток. Используя этот подход, мы изучили 3D-изменения между молочными железами дикого типа и Igfbp7-null.
Общая цель данного видео — представить метод совмещения изображений для трехмерной гистологии и реконструкции объема с целью изучения изменений макроструктуры клеток молочных желез. Для этого через три дня после начала лактации у мышей дикого типа и у мышей с нокаутом белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 7 (IGF BP seven null), проводят иссечение молочных желез. Затем железы обрабатывают и заливают в парафиновые блоки для последующего срезания.
Затем фиксируются изображения поверхности оптического блока тканевых блоков, после чего блоки подвергаются секционированию. Снимаются изображения срезов, и с помощью специализированного программного обеспечения каждый срез сопоставляется с соответствующим изображением поверхности блока для реконструкции гистологического объема молочной железы. Полученные данные позволяют выявить различия в размере желез у мутантного и дикого типов.
Главным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как трехмерная конфокальная двухфокусная микроскопия, является то, что она предоставляет информацию о значительно большем пространственном объеме. Этот метод также может быть использован для исследования и проверки новых методов и алгоритмов в области объемной медицинской визуализации и терапии, а также для создания трехмерного анализа различных органов с высоким разрешением. Данный реконструированный гистологический объем представляет собой достоверное изображение исследуемого образца без накопленной ошибки совмещения.
Идея этого метода возникла у нас, когда мы заметили, что у мышей с нокаутом гена IGF P seven размер помётов меньше и они не способны выносить несколько крупных помётов; поэтому мы решили исследовать структуру их молочных желез. После заливки ткани в парафин используйте роторный микротом, чтобы обрезать блок до полного удаления излишков парафина. Затем с помощью вертикального фрезерного станка просверлите отверстия диаметром 1 мм как минимум в двух углах парафинового блока перпендикулярно кассете, после чего закрепите блок ткани на роторном микротоме.
Затем, чтобы настроить систему визуализации поверхности блока перед микротомом, установите камеру с телеобъективом под небольшим углом к поверхности блока ткани. Камера должна быть подключена к компьютеру, расположенному перед микротомом. После этого разместите источник света перед блоком так, чтобы камера фиксировала отражение света от поверхности блока.
Отрегулируйте угол наклона камеры так, чтобы ткань на поверхности блока была отчетливо видна на фоне окружающего парафина. Сделайте один снимок поверхности блока. Затем с помощью микротома срежьте ленты по четыре среза толщиной 5 мкм.
Перенесите ленты в ванночку с холодной водой, разделите секции ленты, затем извлеките вторую и четвертую секции из холодной воды и поместите их на предметное стекло. Перенесите их в ванночку с теплой водой, чтобы расправить складки. Выбор второй и четвертой секций обеспечивает пятимикронный зазор между срезами.
После того как срезы распрямятся, снова закрепите их на предметных стеклах микроскопа, подхватывая их. Как и прежде, отметим, что резка, монтаж и распрямление срезов могут вызвать некоторые искажения, такие как разрывы, складки, усадка и расширение. Эти артефакты затрудняют совмещение гистологических срезов.
Окрасьте срезы гематоксилином и эозином с помощью автоматического окрасителя. Затем закройте стекла покровными стеклами с помощью автоматического прибора для наложения покровных стекол и оцифруйте препараты при необходимом разрешении, используя цифровой сканер гистологических препаратов. Для данного протокола используется увеличение 20 x и разрешение 0.47 microns.
В этом разделе видео представлен обзор процесса регистрации изображений, который выполняется с помощью специализированного программного обеспечения, разработанного в нашей лаборатории с использованием MATLAB C++ и ITK. Начните с понижения разрешения гистологических изображений до разрешения изображений поверхности блока. Это уменьшит размер гистологических изображений в 0,026 раза.
Затем для сегментации изображений и выбора точек откройте несколько изображений срезов блоков в MATLAB и с помощью инструмента курсора данных (data cursor tool) измерьте значения пикселей в регистрационных отверстиях. Используйте среднее значение пикселей в качестве фиксированного порога для сегментации регистрационных отверстий. Чтобы удалить лишние сегменты, используйте параметры округлости и площади сегментированных объектов, чтобы оставить только отверстия и удалить посторонние сегменты.
Затем для каждой молочной железы выберите одно изображение поверхности блока в качестве эталонного. Совместите центры регистрационных отверстий на остальных изображениях поверхностей блоков с центрами регистрационных отверстий на эталонном изображении. Затем, используя преобразования, полученные для регистрационных отверстий, выровняйте изображения поверхностей блоков; для выровненных изображений поверхностей блоков вручную сегментируйте или извлеките ткань из фона для срезов h и d.
Используйте метод пороговой обработки Оцу для сегментации изображений от фона и создания бинарных масок гистологических срезов. Затем, используя гистограмму размеченных объектов, определите и выберите самый крупный объект в каждой маске. Извлеките граничные точки шириной в один пиксель как из масок гистологических срезов, так и из масок плоскостей блока.
Затем используйте алгоритм дескрипторов Фурье для поиска исходного жесткого преобразования между граничными точками гистологических срезов и соответствующими им изображениями поверхности блока. Это исходное преобразование включает факторы переноса, поворота и масштабирования. Преобразуйте каждое гистологическое изображение с помощью исходного преобразования, полученного на предыдущем этапе.
Для уточнения жесткой регистрации удалите участки контура гистологии с высокой кривизной краев с помощью фильтра «катящегося шара» (rolling ball filter). Затем, используя равномерное распределение, случайным образом выберите 500 точек из оставшихся точек границы гистологии. Преобразуйте точки границы гистологии с помощью начального преобразования, полученного на основе дескрипторов Фурье.
Используйте граничные точки грани блока и алгоритм итеративных ближайших точек для нахождения жесткого преобразования между граничными точками грани блока и гистологией. Произведите выбор случайных граничных точек. Затем трансформируйте гистологические изображения, полученные на предыдущем этапе, чтобы создать визуальное изображение объема гистологии в программном обеспечении для 3D-визуализации.
В программе Me vis lab выберите раздел modules, далее папку miscellaneous и добавьте модуль composed 3D from 2D files. Затем в меню выберите image и добавьте модуль image property convert. Наконец, из раздела modules visualization 3D viewers добавьте модуль view 3D.
Дважды щелкните по пункту «compose 3D from 2D files», чтобы загрузить изображения, и нажмите «create 3D». Отрегулируйте размер вокселя, дважды щелкнув по «image property convert», и установите размер вокселя 0.018 0.018 0.01. Просмотрите объем, дважды щелкнув по «view 3D».
Наконец, просмотрите стек изображений с пятикратным увеличением, следуя инструкциям в прилагаемом документе. Чтобы лучше охарактеризовать дефицит IGFBP7, была выполнена 3D-реконструкция молочных желез мышей с нокаутом данного гена, как описано далее. На этих рисунках представлены реконструированные гистологические объемы молочных желез дикого типа и мышей с нокаутом.
Обратите внимание, что мутантная железа справа короче и уже, чем железа дикого типа слева, но имеет примерно такую же глубину: глубина железы дикого типа составляет 1,06 мм, а нулевой железы — 1,02 мм. Также заметим, что в железах дикого типа слева мало стромальной ткани, что indicated розовым окрашиванием эозином, в то время как нулевые железы справа, по всей видимости, состоят преимущественно из стромальной ткани. Здесь окрашивание гематоксилином и эозином, позволяющее идентифицировать ядерные клетки, показывает, что нулевая железа сохраняет свою плотность, тогда как железа дикого типа, по всей видимости, содержит преимущественно железистые структуры.
Для дальнейшего изучения были выровнены изображения данной области лимфатического узла с более высоким разрешением. Видны крупные структуры, которые должны были быть заполнены молоком. Напротив, железа с делецией гена IGFBP7 содержит лишь несколько хорошо развитых структур.
Более того, эти структуры заполнены клетками, подобными фибробластам. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать 3D-реконструкцию органа путем восстановления последовательных серий сканов. Хорошо. Теперь, при выполнении этой процедуры, важно помнить о необходимости последовательного именования слайдов и сканов, так как их будет большое количество, и именно последовательная организация является залогом успеха при следовании данному протоколу.
Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о том, как сосудистая сеть проникает в опухоль, можно использовать другие методы, такие как иммуногистохимический анализ на специфические маркеры клеток и заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен подход к совмещению изображений для трехмерной реконструкции гистологических объемов с акцентом на изменениях макроструктуры клеток молочной железы. Путем изучения молочных желез мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена Igfbp7 в работе подчеркиваются значительные различия в размере желез.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Гистология
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Понимание развития молочных желез имеет решающее значение для изучения процессов лактации.
- Методы регистрации изображений позволяют улучшить анализ гистологических данных.
- Различия в структуре молочных желез могут указывать на лежащие в их основе биологические механизмы.
- IGF BP seven играет роль в развитии молочных желез.
Цель исследования
- Разработать метод реконструкции трехмерных гистологических объемов.
- Сравнить структурные различия между молочными железами дикого типа и железами с делецией гена IGF BP 7.
- Способствовать более глубокому пониманию клеточных макроструктур в молочных железах.
Используемые методы
- Молочные железы мышей извлекали через три дня после окончания лактации.
- Железы подвергали обработке и заливали в парафиновые блоки.
- Для каждого блока ткани выполняли захват изображений поверхности блока.
- Для объемной реконструкции использовали специализированное программное обеспечение для совмещения изображений срезов с изображениями поверхности блока.
Основные результаты
- Были отмечены значительные различия в размере молочных желез мутантного и дикого типов.
- Метод регистрации изображений позволил эффективно реконструировать гистологический объем.
- Полученные данные дают представление о структурных изменениях в молочных железах.
- Данный подход может быть применен к другим тканям для проведения аналогичных исследований.
Выводы
- Разработанный метод регистрации изображений представляет ценность для трехмерного гистологического анализа.
- Различия в структуре молочных желез могут быть использованы в будущих исследованиях лактации.
- Данный метод может расширить наше понимание клеточной организации в различных биологических контекстах.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет исследователям в области биофармацевтики количественно оценивать трехмерные структурные изменения в тканях молочной железы, что способствует валидации мишеней в биологии молочной железы и путях, связанных с лактацией. Обеспечивая безошибочную реконструкцию гистологического объема, он повышает прогностическую достоверность доклинических моделей развития желез и стромально-эпителиальных взаимодействий. Этот подход облегчает механическое снижение рисков, позволяя проводить прямое сравнение фенотипов дикого типа и мутантных форм с макроструктурным разрешением.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем визуализации макроструктурных различий в молочных железах между моделями дикого типа и моделями с нокаутом IGFBP7.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет надежной 3D-визуализации стромального и железистого компартментов без распространения ошибок регистрации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем создания стандартизированных 3D-томов гистологии с высоким разрешением.
- Практическая ценность: Обеспечение готовности и воспроизводимости анализа за счет согласованного выравнивания срезов и извлечения граничных точек из гистологических изображений и изображений поверхности блока.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует согласованию трансляционных биомаркеров, позволяя визуализировать структурные изменения, связанные с дефицитом IGFBP7, такие как уменьшение размеров желез и увеличение содержания стромы.
- Практическая ценность: обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации, позволяя проводить прямое сравнение морфологии молочных желез мутантного и дикого типов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс исследований — от проверки гипотез на ранних этапах открытия до идентификации ведущих соединений и доклинической валидации, в частности, при изучении биологии молочной железы и сигнальных путей стромы.
- Открывательная биология: способствует проверке гипотез и выяснению путей передачи сигналов, обеспечивая 3D-визуализацию макроструктур молочных желез в генетических моделях.
- Скрининг: повышает готовность к анализу за счет воспроизводимого выравнивания гистологических срезов с использованием изображений лицевой поверхности блока и специализированного программного обеспечения для регистрации.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных, таких как объем, длина, ширина и глубина железы, что позволяет проводить статистическое сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя проводить лонгитюдную структурную оценку процессов лактации и ремоделирования тканей.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемый метод 3D-реконструкции гистологических срезов для различных органов и экспериментальных условий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неоднозначности в моделях развития молочной железы.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря воспроизводимому алгоритму регистрации изображений с использованием ориентиров на срезе ткани и инициализации дескрипторами Фурье.
- Стратегическая ценность: Обосновывает более точные решения о продолжении или прекращении исследований («go/no-go»), предоставляя количественные данные о 3D-фенотипе для приоритизации мишеней в строме молочной железы или эпителиальной сигнализации.
- Влияние на портфель проектов: Обеспечивает принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков за счет объективного объемного фенотипирования генетических моделей.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области гистологии, регистрации изображений и использование специализированного программного обеспечения на базе MATLAB для выбора точек и трансформации.
- Зависимость от оборудования, включая ротационный микротом, вертикально-фрезерный станок, камеру с телеобъективом, источник света, а также системы гистологического окрашивания и сканирования.
- Необходима межкомандная стандартизация именования слайдов, последовательности срезов и захвата изображений поверхности блока для обеспечения точности совмещения.
- При применении метода к другим типам тканей требуются корректировки с учетом различий в размере, жесткости и свойствах окрашивания.
- Практические ограничения включают подверженность артефактам срезов, таким как разрывы, складки и усадка при монтировании, что может затруднить регистрацию.
