Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья

Формирование белковых комплексов в естественных условиях могут быть визуализированы бимолекулярного флуоресценции дополнения. Взаимодействие партнеров сливают с дополнительными частями флуоресцентных меток и временно экспрессированного в листьях табака, в результате чего восстановленного флуоресцентного сигнала при непосредственной близости от двух белков.

Общая цель данного эксперимента заключается в мониторинге взаимодействия двух белков, экспрессируемых в неповрежденных табачных листьях. Это достигается путем разработки соответствующих конструкций, слияния двух интересующих нас генов для расщепления флуоресцентных белков и превращения этих конструкций в агробактерии. На втором этапе культуры агробактерий смешиваются и вводятся в табачные листья, что приводит к экспрессии белков и восстановленному флуоресцентному сигналу.

Если белки оказываются в непосредственной близости, то далее под микроскопом анализируют либо целые листья, либо отдельные протопласты. Получены результаты, показывающие белковые взаимодействия на основе излучаемого флуоресцентного сигнала, обнаруженного с помощью флуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как иммунопреципитация кор или гибрид дрожжей, заключается в том, что взаимодействие белковых белков можно непосредственно контролировать в живой растительной клетке.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии растений, такие как образование белковых комплексов в различных клеточных компартментах. Чтобы начать эту процедуру, вырастите агробактерии, которые будут использоваться для трансформации табачных листьев. Инокулируйте 10 миллилитров среды LB, содержащей соответствующие антибиотики, с 50 микролитрами AG L, одной глицериновой культурой, содержащей интересующую плазмиду, в стерильную 50-миллилитровую пробирку.

Инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение не менее 24 часов, встряхивая со скоростью 190 об/мин до тех пор, пока культура не достигнет наружного диаметра 600 в диапазоне от 1,0 до 2,0 на следующий день. Центрифугируйте бактерии при 3000 умноженных на G в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости суспендируйте гранулу в свежеприготовленной инфильтрационной среде и отрегулируйте суспензию до наружного диаметра 600 или 1,0.

Инкубируйте клетки агробактерий в верхнем шейкере в течение двух часов в темноте при комнатной температуре для проникновения табачных листьев. Выберите несколько старых листьев от трехнедельного растения табака. Смешайте равные объемы.

По три миллилитра каждая из агробактерий, несущих интересующие конструкции. Наполните пятимиллилитровый шприц без иглы смесью клеточной суспензии, чтобы внедрить клеточную суспензию в табачные листья. Осторожно надавите шприцем на нижнюю сторону листьев в нескольких местах, полейте растения и оставьте их накрытыми и защищенными от света на двое суток.

Чтобы изолировать протопласты из инфильтрированного листа, сначала поместите лист в чашку Петри и добавьте немного свежеприготовленного ферментного раствора. С помощью нового лезвия бритвы разрежьте лист на кусочки размером примерно 0,5 квадратного сантиметра. Далее перенесите кусочки листьев с раствором фермента в вакуум.

Инфильтрационная колба. Вакуумируйте в течение примерно 20 секунд, пока из листьев не выйдут пузырьки воздуха. Отпустите пылесос очень осторожно.

Встряхивайте колбу в течение 90 минут при 40 об/мин в темноте при комнатной температуре через 90 минут. Высвобождайте протопласты, встряхивая в течение одной минуты при 90 об/мин. Процедите раствор через марлю в 15-миллилитровую центрифужную пробирку с круглым дном.

Наложите раствор протопластов на два миллилитра буфера FPCN и центрифугируйте в течение 10 минут при 70-кратном перегрузке с медленным ускорением и замедлением при комнатной температуре. Неповрежденные протопласты будут накапливаться на границе раздела между ферментным раствором и FPCN с помощью широкого отверстия, один миллилитр наконечника пипетки перенесет неповрежденные протопласты в свежую центрифужную пробирку. Для успеха этой процедуры всегда используйте белые наконечники отверстий, чтобы предотвратить разрыв неповрежденных протопластов.

Заполните пробирку W пятью буферными центрифугами на две минуты при 100-кратной перегрузке с медленным ускорением и замедлением. Чтобы гранулировать протопласты, осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу. Примерно в 200 микролитрах Вт пять буферов, в зависимости от количества протопластов.

Чтобы подготовить образец протопластов для лазерной сканирующей микроскопии, сначала нанесите две небольшие полоски герметика на расстоянии примерно двух сантиметров друг от друга на предметное стекло микроскопа. Поместите между полосками 20 микролитров раствора протопластов и аккуратно поместите сверху покровное стекло. Полоски герметика предотвратят сдавливание протопластов покровным стеклом.

Чтобы подготовить общий образец листа для лазерной сканирующей микроскопии, отрежьте от листа кусок в один сантиметр и поместите его на предметное стекло микроскопа нижней стороной листа вверх. Добавьте примерно 30 микролитров воды. Сверху поставьте покровное стекло и плотно зафиксируйте его скотчем с двух сторон.

Визуализация выполняется с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа типа MICCA TCS SP five для увеличения. Используйте объектив с амплитудой 63x с глицерином в качестве носителя изображения, используйте передовое флуоресцентное программное обеспечение Leica Application Suite для оценки. Установите Аргоннский лазер на 30%, а мощность лазера на 488 нм на интенсивность 18%Чтобы контролировать его сигнал на 515 нм, установите ширину полосы излучения первого детектора ФЭУ от 495 до 550 нм.

Для контроля автофлуоресценции хлорофилла. Установите ширину полосы излучения второго детектора ФЭУ от 650 до 705 нанометров. Для мониторинга сигнала M cherry используйте лазер HENI 5 61.

Установите интенсивность лазера равной 18% и ширину полосы излучения третьего детектора ФЭУ от 587 до 610 нанометров. Убедитесь, что снимки со всех каналов детектора ФЭУ сделаны с одинаковыми настройками усиления. Коэффициент усиления должен быть в пределах от 800 до 900, чтобы исключить фоновые сигналы.

Получайте изображения в таком формате, шириной и высотой 1024 на 1024 пикселя со скоростью сканирования 100 герц. Для стекирования по оси Z используйте максимальное расстояние 0,5 микрона между каждым стеком. В данном исследовании метод BFC был использован для мониторинга взаимодействия цитозольного молекулярного шаперона HSP 90 с мембранными докинговыми белками TPR 7 и TO 64.

Как показано на этой схеме, Венера связана с цитозольной частью либо TPR 7, которая находится в эндоплазматическом ретикулуме, либо с 64, которая находится во внешней оболочке хлоропластов. Hs.P 90 является N терминально слитым с SCFP, что обеспечивает взаимодействие доменов TPR разговора 64 и TPR 7 С HSP 90 C, Terminus, только SCFP экспрессируется в цитозоле в качестве отрицательного контроля для проверки локализации белкового комплекса TPR 7 HS P 90. TPR 7 и HS P 90 были совместно преобразованы с помощью маркера ER.

Флуоресценцию контролировали в неповрежденных листьях в качестве контроля. Экспрессировался только SCFP вместе с TPR 7 и маркером ER. На всех показанных изображениях масштабная линейка представляет 10 микрон.

На панелях слева показана восстановленная флуоресценция зеленым цветом, контролируемая на 515 нанометрах. Маркер скорой помощи отображается красным цветом. На средних панелях наложение обоих сигналов показано на правых панелях.

Восстановленный сигнал для TPR 7 вместе с HS P 90 перекрывался, при этом маркер ER отображался желтым цветом. В отличие от этого, отсутствовал сигнал для TPR 7 и отрицательный контроль, так как CFP контролировался. В следующем примере белок хлоропластов tox 64 экспрессировался совместно с HS P 90 в качестве контроля.

Tox 64 экспрессировался только совместно с SCFP. Как и ранее, восстановленная флуоресценция в зеленом цвете контролировалась на уровне 515 нанометров. Средние панели показывают автофлуоресценцию хлорофилла, контролируемую на 480 нанометрах.

сигнала показаны на правых панелях. Восстановленная флуоресценция наблюдалась в клетках coex, экспрессирующих tox 64 и HSP 90, но не в клетках. Coex, экспрессирующий только tox 64 и SCFP.

Так как точную локализацию токса 64 и HSP 90 трудно определить на микроскопических снимках целых листьев. Протопласты выделяли из инфильтрированных листьев табака для флуоресцентной микроскопии. Как и ранее, восстановленная флуоресценция контролировалась на 515 нанометрах, автофлуоресценция хлорофилла контролировалась на глубине 480 нанометров, и были созданы наложенные изображения, как показано на этом наложенном изображении, до 64, и HSP 90 может быть обнаружен как кольцеобразные структуры, окружающие хлоропласт Off.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проектировать свои конструкции, трансформировать табачные листья и как лучше всего визуализировать флуоресцентный сигнал, показывающий взаимодействие двух интересующих вас белков.