Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья

Общая цель следующего эксперимента — мониторинг взаимодействия двух белков, экспрессируемых в неповрежденных листьях табака. Это достигается путем создания соответствующих конструкций, слияния двух интересующих генов с разделенными флуоресцентными белками и трансформации этих конструкций в агробактерии. На втором этапе культуры агробактерий смешиваются и вводятся в листья табака, что приводит к экспрессии белков и восстановлению флуоресцентного сигнала.

Если белки оказываются в непосредственной близости друг от друга, далее под микроскопом анализируют либо целые листья, либо изолированные протопласты. В результате определяются белок-белковые взаимодействия на основании флуоресцентного сигнала, регистрируемого методом флуоресцентной микроскопии. Главным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как коиммунопреципитация или дрожжевая двугибридная система, является возможность прямого мониторинга белок-белковых взаимодействий в живой растительной клетке.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии растений, такие как механизмы формирования белковых комплексов в различных клеточных компартментах. Для начала процедуры вырастите агробактерии, которые будут использоваться для трансформации листьев табака. В стерильную пробирку объемом 50 мл внесите 10 мл среды LB с соответствующими антибиотиками и инокулируйте ее 50 µL глицериновой стоковой культуры AG L one, содержащей интересующую плазмиду.

Инкубируйте при 28 °C не менее 24 часов при перемешивании со скоростью 190 об/мин до тех пор, пока на следующий день культура не достигнет OD 600 в диапазоне от 1,0 до 2,0. Центрифугируйте бактерии при 3000 ×g в течение 15 минут. После удаления супернатанта ресуспендируйте осадок в свежеприготовленной инокуляционной среде и доведите плотность суспензии до OD 600 равной 1,0.

Инкубируйте клетки агробактерий в орбитальном шейкере в течение двух часов в темноте при комнатной температуре для последующей инфильтрации листьев табака. Выберите несколько более старых листьев трехнедельного растения табака. Смешайте равные объемы.

По три миллилитра агробактерий, несущих интересующие конструкции. Наберите в пятимиллилитровый шприц без иглы смесь клеточной суспензии для инфильтрации в листья табака. Осторожно прижмите шприц к нижней стороне листьев в нескольких местах, полейте растения и оставьте их под укрытием, в защищенном от света месте, на два дня.

Для выделения протопластов из инокулированного листа сначала поместите лист в чашку Петри и добавьте свежеприготовленный раствор фермента. С помощью нового лезвия бритвы разрежьте лист на кусочки размером примерно 0,5 квадратного сантиметра. Затем перенесите кусочки листа вместе с раствором фермента в вакуум.

Колба для инфильтрации. Проводите вакуумную инфильтрацию в течение примерно 20 секунд, пока из листьев не начнут выходить пузырьки воздуха. Очень осторожно сбросьте вакуум.

После 90 минут встряхивайте колбу в течение 90 минут при 40 RPM в темноте при комнатной температуре. Высвободите протопласты, встряхивая в течение одной минуты при 90 RPM. Профильтруйте раствор через марлю в центрифужную пробирку с круглым дном объемом 15 мл.

Сверху на раствор протопластов аккуратно нанесите 2 мл буфера FPCN и центрифугируйте в течение 10 минут при 70 ×g с медленным ускорением и торможением при комнатной температуре. Целые протопласты накопятся на границе раздела между ферментным раствором и буфером FPCN. С помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл с широким отверстием перенесите целые протопласты в новую центрифужную пробирку. Для успешного выполнения данной процедуры всегда используйте наконечники с широким отверстием (белого цвета), чтобы предотвратить разрыв целых протопластов.

Долейте в пробирку буфер W five и центрифугируйте в течение двух минут при 100 ×g с медленным ускорением и замедлением. Чтобы осадить протопласты, осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте осадок примерно в 200 µL буфера W five, в зависимости от количества протопластов.

Для подготовки образца протопластов для лазерной сканирующей микроскопии сначала нанесите на предметное стекло две узкие полоски герметика на расстоянии около двух сантиметров друг от друга. Нанесите 20 µL раствора протопластов между полосками и осторожно накройте их покровным стеклом. Полоски герметика предотвратят сдавливание протопластов покровным стеклом.

Для подготовки образца целого листа для лазерной сканирующей микроскопии вырежьте фрагмент листа размером один сантиметр и поместите его на предметное стекло нижней стороной листа вверх. Добавьте примерно 30 µL воды. Накройте образец покровным стеклом и плотно зафиксируйте его с обеих сторон с помощью клейкой ленты.

Визуализацию проводят с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа MICCA типа TCS SP five. Для увеличения используют объектив с увеличением 63 x и глицерином в качестве среды для визуализации; для анализа используют программное обеспечение Leica application suite advanced fluorescent. Лазер Argonne устанавливают на 30%, а мощность лазера на длине волны 488 nanometers — на интенсивность 18%. Для мониторинга сигнала на длине волны 515 nanometers ширину полосы излучения первого детектора PMT устанавливают в диапазоне от 495 до 550 nanometers.

Для мониторинга автофлуоресценции хлорофилла установите ширину полосы пропускания излучения второго детектора ФЭУ в диапазоне от 650 до 705 нанометров. Для мониторинга сигнала M cherry используйте лазер HENI 5 61.

Установите интенсивность лазера на 18% и полосу пропускания излучения третьего детектора ФЭУ в диапазоне от 587 до 610 нанометров. Убедитесь, что снимки со всех каналов детекторов ФЭУ получены при одинаковых настройках усиления. Значение усиления должно находиться в пределах от 800 до 900, чтобы исключить фоновые сигналы.

Получайте изображения в данном формате с шириной и высотой 1024 на 1024 пикселя и скоростью сканирования 100 hertz. Для Z-стеков используйте максимальное расстояние 0.5 microns между каждым срезом. В данном исследовании метод BFC использовался для мониторинга взаимодействия цитозольного молекулярного шаперона HSP 90 с мембранными докинг-белками TPR seven и to 64.

Как показано на этой схеме, Venus сопряжена с цитозольной частью либо TPR seven, которая локализована в эндоплазматическом ретикулуме, либо с 64, которая локализована во внешней оболочке хлоропласта. Hs.P 90 слита на N-конце с SCFP, что обеспечивает взаимодействие TPR-доменов talk 64 и TPR seven с C-концом HSP 90. SCFP экспрессируется в цитозоле в качестве отрицательного контроля для проверки локализации белкового комплекса TPR seven HS P 90. TPR seven и HS P 90 были ко-трансформированы с маркером ER.

В качестве контроля проводили мониторинг флуоресценции в неповрежденных листьях. SCFP экспрессировали отдельно, совместно с TPR seven и маркером ЭПР. На всех представленных изображениях масштабная линейка соответствует 10 microns.

На панелях слева зеленым цветом показана реконструированная флуоресценция, регистрируемая на длине волны 515 нанометров. Маркер ЭПР отображается красным цветом. На средних панелях показано совмещение обоих сигналов, а на правых панелях — их наложение.

Реконструированный сигнал TPR7 совместно с HSP90 наблюдался в области перекрытия с маркером ЭПР, что отображалось желтым цветом. Напротив, сигнал для TPR7 и отрицательного контроля в виде CFP не обнаруживался. В следующем примере белок хлоропластов TOX64 был коэкспрессирован с HSP90 в качестве контроля.

Tox 64 экспрессировали совместно только с SCFP. Как и прежде, восстановленную зеленую флуоресценцию регистрировали на длине волны 515 нанометров. На средних панелях показана автофлуоресценция хлорофилла, регистрируемая на длине волны 480 нанометров.

На правых панелях представлено совмещение обоих сигналов (красным цветом). Восстановленная флуоресценция наблюдалась в клетках, коэкспрессирующих tox 64 и HSP 90, но не в клетках, коэкспрессирующих только tox 64 и SCFP.

Поскольку точная локализация tox 64 и HSP 90 трудноопределима на микроскопических снимках целых листьев, для флуоресцентной микроскопии были выделены протопласты из инфильтрированных листьев табака. Как и ранее, мониторинг восстановленной флуоресценции проводили при 515 нанометрах, мониторинг аутофлуоресценции хлорофилла — при 480 нанометрах; также были созданы совмещенные изображения, как показано на данном снимке, где tox 64 и HSP 90 видны в виде кольцевых структур, окружающих хлоропласт.

После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как конструировать векторы, трансформировать листья табака и как наилучшим образом визуализировать флуоресцентный сигнал, свидетельствующий о взаимодействии двух изучаемых белков.