Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио

Общая цель данного эксперимента заключается в качественном и количественном измерении окислительного стресса в живых эмбрионах рыб данио-рерио. Это достигается путем добавления окислительного раствора в подготовленные эмбрионы для индукции окислительного стресса или путем создания края раны в хвостовом плавнике эмбриона. Затем эмбрионы обрабатываются для обнаружения окислительного стресса либо методом одной клетки, либо методом цельного монтирования.

Далее препараты инкубируют с помощью зонда для обнаружения Росса. Результаты могут показать величину окислительного стресса и уровень Росса на основе конфокальной микроскопии отверстий или цитофлюорометрического анализа отдельных клеток. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как иммунофлюор для маркеров кислородного стресса, заключается в том, что она позволяет проводить необработанное детектирование в контексте живого организма и количественное определение на уровне отдельных тканей.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фундаментальных исследований, таких как изучение состояний окислительного стресса в контексте патологического состояния. У новичков могут возникнуть трудности из-за случайного повреждения тканей, потому что необработанные чувствительные молекулярные зонды могут быть незапланированным источником кислотности. И поскольку высокие уровни окислительного стресса должны приводить к гибели клеток, в то время как слишком малый уровень может быть трудно обнаружить с помощью практики и экспериментов, эти проблемы возникнут только сами по себе.

Обратите внимание на указанные меры предосторожности. Зондовый раствор для обнаружения отверстий по горе Росса не должен подвергаться воздействию света или кислорода во время его подготовки, и он должен быть подготовлен свежим для метода обнаружения Росса с одной ячейкой. Стоп-раствор FBS в PBS должен быть приготовлен и храниться при температуре четыре градуса Цельсия.

Другие подготовительные меры включают в себя настройку воздушного инкубатора данио-рерио на 28 градусов Цельсия и для одноклеточного метода охлаждение центрифуги до четырех градусов Цельсия. Проводится скрещивание данио-рерио, сбор эмбрионов и обезболивание. Используя стандартную методологию, соберите интересующие эмбрионы в период от 48 до 72 часов после оплодотворения.

После обезболивания эмбрионы дважды вымывают анестетик, затем загружают эмбрионы в три чашки, не более 30 на чашку для обнаружения одноклеточного сырья. Соберите не менее 35 эмбрионов в нескольких чашках. Далее применяют 10 миллилитров раствора окислителя или в качестве отрицательного контроля.

Нанесите 10 миллилитров воды, затем подождите от 10 до 60 минут, пока эмбрионы инкубируются при температуре 28 градусов Цельсия. Также подогрейте HBSS до 28 градусов по Цельсию для стирки. После инкубации переложите эмбрионы в новую посуду с теплым HBSS и перемешайте.

Затем перейдите к обнаружению Росса целиком или одной ячейкой. Более физиологичным вариантом является создание стресса после повреждения тканей с помощью техники ранения хвостового плавника, описанной NI Tomer and компанией. После обработки оксидантами группы до 10 эмбрионов переносят в небольшие пробирки.

Тщательно промойте их с помощью HBSS и защитите от света фольгой. Затем добавьте миллилитр необработанного раствора для обнаружения в каждую пробирку и инкубируйте пробирки в течение 15 минут при температуре 28 градусов Цельсия, пока они инкубируются. Подготовьте предметное стекло, содержащее как контрольное, так и экспериментальное условие.

Накройте углубление предметным стеклом 300 микролитрами метилцеллюлозы. Не образуйте пузырей при выбросе метилцеллюлозы. После инкубации эмбрионов быстро замените раствор в пробирках двумя миллилитрами HBSS и несколько раз переверните пробирки, чтобы промыть эмбрионы.

Затем отсасывайте эмбрионы в кончик микропипетки и аккуратно выбрасывайте их в обработанное предметное стекло. Сориентируйте эмбрионы с помощью тонкой нейлоновой линии и продолжайте использовать флуоресцентный или конфокальный сканирующий микроскоп для анализа. Обязательно анализируйте все эмбрионы при одинаковых настройках.

Перенесите эмбрионы из промывки HBSS в новую посуду, удалив как можно больше раствора. Теперь вручную удалите покрытие с эмбрионов. Это действительно необходимо для диссоциации эмбрионов на отдельные клетки.

Затем переместите эмбрионы в 24-луночный планшет, загрузите по 15 эмбрионов в каждую. Хорошо заполнить по три лунки для каждого состояния. Далее удалите весь раствор и замените его на 300 микролитров HBSS, 30 микролитров коллагеназы р и 50 микролитров трипсина ЭДТА.

С помощью наконечника пипетки объемом в один миллилитр гомогенизируйте эмбрионы триером. После того, как все лунки подготовлены, переносите пластину на температуру 28 градусов Цельсия не менее чем на 20 минут каждые пять минут, тритируйте образцы, чтобы обеспечить хорошую гомогенизацию. Также положите на лед несколько микропробирок, чтобы собрать ткани, когда они будут готовы.

Через 20 минут возьмите образец и проверьте, что ткань разрушена в одноклеточную суспензию под микроскопом. Если нет, продолжайте инкубацию в общей сложности до 30 минут. Когда ткань будет готова, остановите реакцию с помощью дополнительных 200 микролитров стоп-раствора.

Смешайте его с TRI с помощью наконечника для дозатора объемом в один миллилитр. Затем переложите содержимое каждой лунки в предварительно охлажденную микропробирку и держите эти пробирки на льду вдали от света. Затем центрифугируйте образцы при давлении 250 GS в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

А затем удалить надосадочную жидкость методом аспирации. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в ледяном HBSS с помощью щадящего три, и убедитесь, что суспензия содержит не менее 2 миллионов клеток. Далее повторно суспендируйте клетки в миллилитре необработанного чувствительного раствора зонда.

Инкубируйте их при комнатной температуре и в темноте около трех минут. Отрегулируйте это время инкубации опытным путем. Затем перенесите ячейки в факсимильные трубки, защищенные от света.

Проведите анализ по факсу для обнаружения трансгенного маркера. Флуоресценция и флуоресценция зонда Росса во время анализа. Всегда рассчитывайте уровни потерь при увеличении в разы по сравнению с контрольными образцами, чтобы нормализовать фоновую флуоресценцию.

Все обнаружения Маунт-Росс были использованы для изучения скопления перекиси водорода в месте раны. Неповрежденные и поврежденные хвосты сравнивали после 20 минут обработки окислителями. В обоих условиях был обнаружен неспецифический сигнал.

Такой же эксперимент с предварительной обработкой эмбрионов для снижения уровня перекиси водорода. Использование ингибитора OX VA 28 70 показало, что обнаруженные сигналы действительно зависят от гнили накопления Росса. Известные обработанные эмбрионы также были исследованы целиком.

При большом увеличении можно было идентифицировать анатомические области. Полученный Росс, на что указывает флуоресцентный подсчет Росс-положительных клеток по факсу, был выполнен для обнаружения Росса одиночной клетки. Этот анализ проводился без включения мертвых клеток. Контроль.

Также были проанализированы клетки без лечения. Сравнение этих результатов сделало количественную оценку накопления Росса очень простой. Этот тест отлично подходит для тестирования любого количества экспериментальных манипуляций.

После того, как вы освоите это, технику можно выполнить за 90 минут, если она выполнена правильно. Не стоит забывать, что работа с молекулярными зондами может быть крайне опасной и предвестником. Такое использование перчаток всегда должно приниматься во время выполнения этой процедуры.