Гармоник Наночастицы регенеративной исследований

Общей целью данного эксперимента является мониторинг in vitro кластеров сердечных шариков, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, в 3D реальном времени и с высоким пространственным разрешением. Это достигается путем предварительного культивирования и наращивания эмбриональных стволовых клеток до тех пор, пока они не сформируют тельца Эмбри. Затем бьющие кластеры рассекаются и покрываются на пористых фильтрах из ПОЛИТЕТРАФТОРЭТИЛЕНА или ПТФЭ, что позволяет поддерживать их в качестве воздуха длительного пребывания.

Жидкие культуры, которые затем бьются в кластеры, помечаются гармоническими наночастицами для выполнения многофотонной микроскопии в реальном времени. Полученные результаты позволяют проанализировать пространственное удлинение и частоту сердечных сокращений в микроскопическом масштабе. Таким образом, основное преимущество этих наночастиц заключается в том, что вы можете использовать любую длину волны, особенно инфракрасную, поэтому вы можете проникнуть глубже в ткани, и они также очень стабильны с течением времени.

Таким образом, мы можем отслеживать наши длительные процессы на длительных временных интервалах. Этот метод культивирования стволовых клеток может помочь ответить на ключевые вопросы в области функционального сокращения кардиомиоцитов в трех измерениях. В частности, созревание сердца и тканевая инженерия.

Люди, использующие новый метод заболевания, должны знать, что процедура мечения гармоническими наночастицами может быть использована только для многофотонной микроскопии и не может быть перенесена на другие виды систем визуализации. Впервые идея использования гармонических наночастиц появилась у нас в 2005 году. Эти наночастицы имеют преимущества по сравнению с флуоресцентными красителями и квантовыми точками.

На самом деле, их сигнал не затухает со временем, и их можно использовать для мониторинга разрабатываемых образцов в течение длительных периодов времени. Визуальная демонстрация подготовки образца имеет решающее значение для эффективности и воспроизводимости различных этапов, в частности, при проведении тестирования лекарственных препаратов, а также может применяться к различным тканям или заболеваниям. Моделирование тканей.

После культивирования и расширения человеческих эмбриональных стволовых клеток или ЭСК в соответствии с текстовым протоколом и инкубации их с теплой коллагеназой в течение 10 минут соберите фрагменты колонии в два миллилитра свежей дифференцировки, среды или ДМ и центрифугируйте при 115-кратной гравитации в течение трех минут. Культура, колония фрагментируется во взвешенном состоянии в сверхнизких прикреплениях. Шесть лунок в течение четырех дней, чтобы позволить им сформировать тела эмбриона или ЭБС.

Затем нанесите пластину на новообразованную EBS на 0,1% желатина и покрыли 24 лунки в течение 15-30 дней до появления бьющихся гроздей. Удалите PBS и с помощью acutus диссоциируйте колонии на отдельные клетки после центрифугирования и ресусси, суспендируя клетки в DM medium plate по два миллилитра на агро. Хорошо камеру и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение суток.

Соберите вновь сформированную EBS и наберите по три пластины в лунку на 24 луночных пластинах, покрытых 0,1% желатином, после двух-четырех недель в культуре. Определите скопления бьющихся кардиомиоцитов и с помощью удлиненной остро надрезанной пастообразной пипетки вручную рассеките их. Поместите четыре фильтра из ПТФЭ на каждую вставку и поместите каждый в лунку с шестилуночным планшетом.

После добавления одного миллилитра ДМ в каждый фильтр добавьте по одному расчлененному бичевающему кластеру на каждый фильтр из ПТФЭ. Чтобы промаркировать кластеры, переложите фильтры из ПТФЭ с отбивающими кластерами в чашку со стеклянным дном диаметром 3,5 сантиметра. Добавьте один миллилитр наночастиц второго гармонического поколения в концентрации 50 микрограммов на миллилитр и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия для получения нелинейной оптической визуализации.

После переноса меченых HEBs или кластеров сердечного ритма в камеру визуализации используйте широкоугольную визуализацию при освещении белым светом для идентификации представляющих интерес структур в рамках дифференцированных EBS или кластеров активного биения. Выполните быстрое трехмерное сканирование с низким разрешением, чтобы восстановить общую морфологию сердечного кластера и выбрать плоскость изображения в объеме кластера с несколькими видимыми наночастицами генерации второй гармоники для мониторинга в режиме реального времени. Сокращения сердечного кластера переводят оптический сканер микроскопа в самый быстрый режим, позволяя получать двухмерные изображения с частотой в несколько герц.

Проанализируйте изображения с помощью программного обеспечения MATLAB в соответствии с текстовым протоколом, как показано здесь, прежде чем оценивать активность биения. Определение характеристик нелинейного оптического отклика фильтров из ПТФЭ выполняется для того, чтобы убедиться, что голая подложка для флуоресценции фотонов очень слаба и не может препятствовать измерению соответствующих биологических образцов и изолированного излучения. Наночастицы второго поколения гармоник могут быть легко получены путем визуализации через подложку в режиме эпи-детектирования.

На этом рисунке показано лезвие наночастиц второго поколения гармоник, меченных сердечными структурами и EBS. Красный, желтый и зеленый цвета соответствуют автофлуоресценции NADH, в то время как интенсивные синие пятна второй гармоники возникают из изолированных наночастиц второго поколения гармоник. Обратите внимание на хороший оптический контраст и относительно разреженную маркировку по сравнению с квантовыми точками или наночастицами с повышающим преобразованием.

На этом рисунке показан срез наночастиц второго гармонического поколения, помеченных кластером сердечных сокращений. Как показано в этом фильме, 3D-структуры записываются с высокой скоростью, чтобы контролировать характер сжатия во второй ячейке. Наночастицы генерации гармоник агрегируются для поддержания высокой скорости сбора данных для разрешения движения NP.

Общая чувствительность сбора данных была недостаточной для регистрации автофлуоресценции ячейки с излучением второй гармоники от генерации второй гармоники. Анализ изображений наночастиц, выполненный на кадрах фильма, показывает, что в пределах одного и того же сердечного кластера смещение составляет порядка нескольких микрометров, а частота постоянна для движения наночастиц второй и второй гармоники. При освоении техники препарирования клеток, рассечение кластера ставок, воздушная жидкая культура и окотание могут быть выполнены в течение 24-36 часов при правильном выполнении.

В частности, при использовании этой технологии необходимо избегать контактов на открытом воздухе, чтобы предотвратить загрязнение. Следуя этой процедуре, можно применять другие методы, такие как электрофизиологическая запись с использованием нескольких электродных матриц, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как корреляция профилей потенциала действия с частотой биения в трех измерениях. Наша новая методика, основанная на детектировании нелинейного сигнала гармоническими наночастицами, может быть усовершенствована для исследований in vivo, которые заражают длины волн, используемые для визуализации, что позволяет глубже проникать в ткани.

Одним из возможных разработок может быть последующая интеграция структуры, полученной из стволовых клеток, для применения в регенеративной медицине.