Гармоник Наночастицы регенеративной исследований

Общая цель следующего эксперимента заключается в мониторинге in vitro сокращающихся кардиальных кластеров, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, в 3D в режиме реального времени и с высоким пространственным разрешением. Для этого сначала проводят культивирование и экспансию эмбриональных стволовых клеток до образования эмбриоидных телец. Затем сокращающиеся кластеры выделяют и высевают на пористые фильтры из ПОЛИТЕТРАФТОРЭТИЛЕНА (PTFE), что позволяет поддерживать их в течение длительного времени на границе раздела фаз воздух-жидкость.

Затем жидкие культуры с пульсирующими кластерами маркируют гармоническими наночастицами для проведения многофотонной микроскопии в реальном времени. Полученные результаты позволяют анализировать пространственное удлинение и частоту сердечных сокращений на микроскопическом уровне. Таким образом, основным преимуществом этих наночастиц является возможность использования любой длины волны, особенно инфракрасной, что позволяет проникать глубже в ткань, а также их высокая стабильность с течением времени.

Таким образом, мы можем контролировать длительные процессы в течение продолжительных периодов времени. Данный метод культивирования стволовых клеток может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области функционального сокращения кардиомиоцитов в трех измерениях, в частности, в вопросах созревания сердечной ткани и тканевой инженерии.

Лицам, впервые использующим данный метод, следует знать, что процедура маркировки гармоническими наночастицами может применяться только для многофотонной микроскопии и не может быть перенесена на другие типы систем визуализации. Идея использования гармонических наночастиц впервые возникла у нас в 2005 году. Данные наночастицы обладают рядом преимуществ по сравнению с флуоресцентными красителями и квантовыми точками.

На самом деле, их сигнал не затухает со временем, и они могут быть использованы для мониторинга развивающихся образцов в течение длительных периодов времени. Визуальная демонстрация подготовки образца имеет решающее значение для эффективности и воспроизводимости различных этапов, в частности при проведении тестирования лекарственных препаратов, и может быть также применена к различным тканям или заболеваниям. Моделирование тканей.

После культивирования и экспансии эмбриональных стволовых клеток человека или ESC согласно текстовому протоколу и инкубации с теплым коллагеназой IV в течение 10 минут, соберите фрагменты колоний в 2 mL свежей среды для дифференцировки или DM и центрифугируйте при 115 ×g в течение 3 минут. Культивируйте фрагменты колоний в суспензии в 6-луночных планшетах с ультранизкой адгезией в течение 4 дней, чтобы дать им сформировать эмбриоидные тельца или ebs.

Затем высейте вновь сформированные EBS на 24-луночные планшеты, покрытые 0,1% желатином, на 15–30 дней до появления сокращающихся кластеров. Удалите PBS и с помощью аккутуса диссоциируйте колонии до состояния отдельных клеток после центрифугирования и ресуспендирования; перенесите по 2 мл клеток в каждую лунку планшета в среде DM и инкубируйте при 37 °C в течение одного дня.

Соберите вновь сформированные EBS и, спустя две-четыре недели культивирования, высейте по три EBS в каждую лунку 24-луночного планшета, покрытого 0,1% желатином. Идентифицируйте кластеры сокращающихся кардиомиоцитов и вручную выделите их с помощью вытянутой пастеровской пипетки с остро срезанным концом. Поместите по четыре PTFE-фильтра в каждый инсерт, а затем установите инсерты в лунки 6-луночного планшета.

После добавления одного миллилитра DM в каждую лунку поместите один препарированный бьющийся кластер на каждый ПТФЭ-фильтр. Чтобы пометить кластеры, перенесите ПТФЭ-фильтры с бьющимися кластерами в стеклянную чашку с дном диаметром 3,5 сантиметра. Добавьте один миллилитр наночастиц для генерации второй гармоники в концентрации 50 µg/mL и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C для проведения нелинейной оптической визуализации.

После переноса меченых HEB или сокращающихся сердечных кластеров в камеру для визуализации используйте широкопольную микроскопию при освещении белым светом для идентификации интересующих структур внутри дифференцированных EBS или активных сокращающихся кластеров. Выполните быстрое трехмерное сканирование с низким разрешением для реконструкции общей морфологии сердечного кластера и выберите плоскость изображения в объеме кластера, содержащую несколько видимых наночастиц с генерацией второй гармоники, для мониторинга в режиме реального времени. Сокращения сердечного кластера требуют перевода оптического сканера микроскопа в максимально быстрый режим, что позволяет осуществлять многогерцевый сбор двухмерных изображений.

Проанализируйте изображения с помощью программного обеспечения MATLAB в соответствии с текстовым протоколом, продемонстрированным здесь, перед оценкой сократительной активности. Характеристика нелинейного оптического отклика фильтров из PTFE проводится для того, чтобы убедиться, что флуоресценция самого субстрата при облучении фотонами очень слабая и не препятствует измерению соответствующих биологических образцов; также эмиссия от изолированных наночастиц со второй гармоникой может быть легко зафиксирована при получении изображений через субстрат в режиме эпи-детектирования.

На данном рисунке представлены структуры сердца и EBS, меченные наночастицами для генерации второй гармоники. Красный, желтый и зеленый цвета соответствуют автофлуоресценции NADH, в то время как интенсивные синие пятна второй гармоники обусловлены изолированными наночастицами для генерации второй гармоники. Обратите внимание на хороший оптический контраст и относительно редкую маркировку по сравнению с квантовыми точками или наночастицами с ап-конверсией.

На этом рисунке представлен срез кластера бьющихся кардиомиоцитов, маркированных наночастицами для генерации второй гармоники. Как показано в этом видео, 3D-структуры регистрируются с высокой скоростью для мониторинга характера сокращения во второй клетке. Наночастицы для генерации второй гармоники агрегируют для обеспечения высокой скорости сбора данных с целью разрешения движения НЧ.

Общей чувствительности системы сбора данных было недостаточно для регистрации аутофлуоресценции клеток вместе с эмиссией второй гармоники при генерации второй гармоники. Анализ изображений наночастиц, выполненный на кадрах видеозаписи, показывает, что смещение внутри одного и того же кардиального кластера составляет порядка нескольких микрометров, а частота движения наночастиц при генерации второй гармоники постоянна как в плоскости, так и вне ее. При освоении метода подготовки клеток препарирование кластера, создание культуры «воздух-жидкость» и ламбирование могут быть выполнены за 24–36 часов при условии правильного проведения процедуры.

Особенно при использовании данной методики необходимо избегать контакта с открытым воздухом для предотвращения контаминации. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как электрофизиологическая регистрация с использованием многоэлектродных матриц, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о корреляции профилей потенциала действия с частотой сокращений в трехмерном пространстве. Наша новая методика, основанная на детектировании нелинейного сигнала гармоническими наночастицами, может быть в дальнейшем развита для исследований in vivo, поскольку используемые для визуализации длины волн обеспечивают более глубокое проникновение в ткани.

Одним из возможных направлений развития может стать интеграция структур, полученных из стволовых клеток, для применения в регенеративной медицине.