Маркировка сотовый и впрыска в развивающихся эмбриональных сердце мыши

Общая цель этой процедуры заключается в проведении инъекции клеток гибель, или ДНК в эмбриональные сердца мышей. Для того, чтобы исследовать клеточный жир или локально манипулировать экспрессией генов, это достигается путем препарирования эмбрионов беременной мыши и обнажения эмбрионального сердца. Затем ДНК-краситель или клетки вводятся в целевую область сердца в целом.

Затем, после инкубации эмбриона, сердце удаляют и помещают в культуру. Наконец, судьба введенных или помеченных клеток определяется с помощью микроскопии. В конечном счете, судьба введенных, меченых или генетически модифицированных клеток контролируется с помощью конфокальной микроскопии или световой и эпифлуоресцентной микроскопии, выявляющей функциональную важность конкретных генов и клеток во время развития сердца.

Основное преимущество этой техники по сравнению с существующими методами, такими как трансгенез у мышей, заключается в том, что мы можем локально и точно вводить лабораторные или генетически модифицировать клетки in vivo. Это позволяет исследовать эти клетки в надлежащих условиях. Демонстрировать эту процедуру будем я и Эмили Аар, аспирантка лаборатории.

После подготовки оборудования, реагентов и растворов, согласно текстовому протоколу, соберите эмбрионы Е 9.5 и Е 10.5 от усыпленной беременной мыши, сначала используя 70% этанол для стерилизации грудной клетки, сделайте вентральный разрез по средней линии для вскрытия брюшной полости и извлеките маточный рог перед переносом его в PBS комнатной температуры. После двух дополнительных стирок в PBS переложите его в чашку Петри, наполненную силиконом. При использовании среды М 16 используйте булавки от насекомых, чтобы приколоть маточный рог к силиконовому слою так, чтобы васкуляризированная сторона матки оказалась под ним.

Затем с помощью тонких щипцов разрежьте поверхность матки и закройте лиственную ткань на глубине одного миллиметра ниже поверхности. Разложите стенки децидуа и аккуратно достаньте зародыш в желточном мешке. Храните его в М 16, средней температуре при 37 градусах Цельсия перед инъекцией клеток для проведения инъекций.

Сначала с помощью шприца Гамильтона заполните стеклянную пипетку с обратной стороны ДНК или клетками, а затем встряхните пипетку, чтобы удалить пузырьки. На кончике поместите пипетку на держатель микровпрыска и установите инжектор в соответствии со следующими настройками. Далее приколите эмбрион к силиконовому дну через желточный мешок, не касаясь самого эмбриона.

Затем определите область сердца и откройте мешок чуть выше этой области. Добавьте четыре булавки вокруг эмбриона, чтобы предотвратить любое движение во время инъекции клеток. С помощью микроманипулятора, настроенного в ручном режиме, медленно расположите наконечник пипетки под углом 45 градусов над перикардом, прямо над областью сердца, в которую будет сделана инъекция.

Переместите пипетку в интересующую область, запустите инъекцию и как можно быстрее извлеките пипетку. Убедитесь, что сердце правильно бьется после инъекции ДНК или клеток Используя протокол инъекции, описанный в этом видео, для изучения эпителиального перехода в мезенхиму и E 9,5 A VC explan был введен S-H-R-N-A, который подавляет белок, необходимый для эндотелиального мезенхимального перехода эндокардиальных клеток. Контрольному эмбриону вводили пустой основной вектор, кроме того, эндотелиальные преклапанные клетки, полученные из клеток HUES, экспрессирующие GFP под контролем промотора SOX nine, вводили в VC A в точке E 10,5, после чего в течение 48 часов проводили эксплантированное бактериологическое исследование сердца.

Эти клетки приобретают маркеры ЭМП, такие как периостин, подобно эндогенным клеткам эндокарда. Представленные здесь подходы ex vivo относительно просты, но ограничены максимальным краткосрочным наблюдением от 48 до 72 часов. Тем не менее, процедура инъекции под ультразвуковым контролем, описанная в текстовом протоколе, обеспечивает технически более сложный подход, но с возможностью длительного даже постнатального внутриутробного наблюдения.

Здесь показана внутриутробная инъекция красителя или вирусных векторов для мечения клеток в определенных областях сердца. С помощью этого метода можно добиться специфического мечения эпикардиальных клеток с помощью флуоресцентных красителей или вируса, а также расширить этот метод с помощью клеток или альтернативных инъекционных препаратов. Следуя этой процедуре, можно провести такой метод, как культивирование мошек, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как долгосрочное влияние гена, молекулы или длинного списка, например, морфогенез тканей после их развития.

Этот метод проложил путь для исследователей в области биологии развития сердца и генетики. Это позволяет нам исследовать мир новых генов, а также исследовать судьбу клеток человека в надлежащем эмбриональном контексте. Это очень полезно, когда трансгенная линейка мышей недоступна.