Долгосрочный Прижизненные Иммунофлуоресценции Визуализация тканей компонентов матрицы с эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии

Общая цель данной процедуры заключается в проведении внутрижизненной иммунофлуоресцентной визуализации уха мышей-носителей меланомы для изучения динамики матриксных компонентов опухолевой ткани. Это достигается путем первичной инокуляции мышиного уха GFP, экспрессирующим клетки меланомы B 16 F 10. Следующая операция проводится на ухе мыши, чтобы отделить вентральную кожу от кожи тыльного уха и обнажить опухолевую ткань.

Затем проводится иммуноокрашивание открытых тканей тыльной стороны уха. Наконец, животное подготавливается к внутрижизненной визуализации. В конечном счете, флуоресцентная стереомикроскопия или многофотонная микроскопия используется для определения локализации и динамического поведения опухолевых клеток и их матричных компонентов.

Основное преимущество этого метода по сравнению с другими методами визуализации в реальном времени заключается в том, что мы можем визуализировать динамические взаимодействия опухолевых клеток со стромальными ассоциированными клетками, такими как иммунные клетки, но это происходит в контексте фибриллярного и сетчатого внеклеточного матрикса. Таким образом, этот метод может помочь вам решить ключевые вопросы в области биологии опухолей, такие как взаимодействие опухолевых клеток с их физическим микроокружением, что, в свою очередь, может дать важную информацию о том, как развиваются опухоли. Некоторая часть процедуры будет продемонстрирована Витой Кки, старшим научным сотрудником нашей лаборатории. Чтобы подготовить опухолевые клетки к инъекции, начните с культивирования клеток меланомы B 16 F 10 GFP.

После центрифугирования клетки переложите их в пробирку эйнора объемом 1,5 миллилитра и снова вращайте, удалите всю надосадочную жидкость, кроме тонкого слоя среды, который остается чуть выше гранулы, повторно суспендируйте клетки в густую клеточную кашу рядом с ней, чтобы загрузить клеточную кашу в объем 10 микролитров. Шприц Гамильтона. Снимите колпачок наконечника с прикрепленной иглы 33 калибра и загрузите 20 микролитров суспензии в верхнюю часть камеры наконечника.

Затем потяните поршень назад, пока в шприц не загрузится пять микролитров суспензии. После обезболивания мыши C 57 black six с инъекционной анестезией выбрейте голову мыши, удалите волоски на голове и вокруг уха и промойте водой. С помощью лейкопластыря зафиксируйте проксимальный край уха на кончике указательного пальца.

Введите иглу шприца Гамильтона между тыльной стороной дермы и хрящом уха мыши C 57 black six, проникая в ухо от проксимального до дистального примерно на два-три миллиметра. Введите клеточную суспензию и медленно втяните иглу от кожи. Дайте опухолевым клеткам сформировать твердую опухоль в течение семи-девяти дней, используя флуоресцентный микроскоп для отслеживания роста опухоли.

После использования смеси увлажненного кислорода и изофтора для обезболивания мыши поместите мышь на грелку с температурой 37 градусов Цельсия и выполните легкое пощипывание пальцев ног. Чтобы подтвердить, что животное достаточно обезболито. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза и держите мышь на ректальной грелке, управляемой термистором, на протяжении всей процедуры.

Далее аккуратно поместите ухо, несущее опухоль, на стопку стеклянных предметных стекол. Затем с помощью небольших полосок лейкопластыря зафиксировать передний и задний края уха к стеку с помощью скальпеля, разрежьте вентральную кожу уха по антиспирали ушной раковины мыши. Снимите ленты с уха с помощью изогнутого пинцета.

Аккуратно отшелушите вентральную дерму и хрящи с тыльной стороны дермы. Используйте буфер Рингера для промывания уха, чтобы провести иммунофлуоресцентное окрашивание. Нанесите первичные антитела, нацеленные на молекулы внеклеточного матрикса в блокирующем буфере, на открытое ухо и наложите сверху покровную салфетку.

Инкубируйте в течение 15 минут, прежде чем использовать примерно пять миллилитров буфера для промывания уха дважды. Внесите соответствующие вторичные антитела или стрептококк Адена в блокирующий буфер. Нанесите чехол и выдержите в течение 15 минут перед умыванием дважды Как и раньше, сложите открытую дермальную область в EM mencia conki и используйте стерильные салфетки для сушки наружной неоткрытой дермы уха.

Поместите ухо на стопку стеклянных предметных стекол и нанесите 0,5 микролитра хирургического клея на передний и задний дорсальные края, чтобы обездвижить его для кратковременной визуализации в течение двух часов или менее. Добавьте свежеприготовленный стерильный в качестве сорбата буфер для звонков поверх обездвиженного уха и наложите покровный слип. Затем используйте флуоресцентный стереомикроскоп с двумя линзами для визуализации уха.

Для долговременной визуализации. Поместите выходное отверстие иглы, прикрепленной к резервуару, содержащему сорбат, под крышкой слипа примерно в 0,5 сантиметрах от уха. Используйте перистальтический насос со скоростью один микролитр в минуту, чтобы постоянно доставлять буфер в камеру.

Откройте программное обеспечение для сбора данных. Отрегулируйте усиление, интенсивность флуоресценции, увеличение и время экспозиции изображения, несколько полей, которые содержат опухолевые клетки, а также окрашенные белки внеклеточного матрикса для проведения внутрижизненной визуализации с помощью многофотонной микроскопии с кремниевой смазкой. Начиная с основания уха.

Постройте вокруг уха круглую стенку диаметром около двух сантиметров и высотой два-три миллиметра. Заполните круг сорбатом рингеров. Поместите мышь на столик на грелку, установленную на 37 градусов Цельсия и настройте параметры микроскопа согласно текстовому протоколу.

Как показано на этом рисунке, многие структуры можно различить на основе их морфологии после иммуноокрашивания. Для компонентов базальной мембраны, таких как коллаген 4 или пролин, что наиболее важно, структурные белки, которые обычно не могут быть обнаружены ГСП. Классический матричный метод детектирования может быть визуализирован.

Например, мы обнаружили, что tens и C откладываются в различных локализациях опухолевой стромы от фибриллярных коллагенов, силы, развивающиеся в микроокружении опухоли, могут привести к расширению или сокращению опухолевого матрикса, и, как следствие, к ремоделированию сосудистой сети опухоли по аналогии с заживлением раны. Здесь мы показываем, что мы можем выполнять двухфотонную покадровую микроскопию, одновременно визуализируя иммуномеченые тены и С-матрицу с минимальным фотообесцвечиванием Fluor-четверок, даже при высокой плотности фотонов для фотонной микроскопии. На этом видео опухолевые клетки, которые были наложены на обнаженную дерму, предварительно окрашенную на четыре коллагена, прилипли к ткани и в группах начали коллективно мигрировать вдоль базальной мембраны кровеносных сосудов и жировых участков.

После освоения вся процедура вскрытия уха и иммуноокрашивания занимает два часа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить прижизненное иммуноокрашивание для изучения взаимодействий клеточного матрикса в опухолях с помощью эпифлуоресценции или двухфотонной микроскопии.