Клеточная терапия для сердечной недостаточности у крыс: Двухместный Торакотомия для инфаркта миокарда и эпикарда Имплантация клеток и Biomatrix

Целью данной процедуры является выполнение двойной торакотомии у крыс для проведения перевязки коронарной артерии и эпикардиального нанесения препарата. Сначала выполняется торакотомия в четвертом межреберье. Затем производится перевязка передней нисходящей ветви левой коронарной артерии (LAD).

Затем через две недели выполняется вторая торакотомия в пятом межреберье. В завершение клетки и матрикс наносятся на поверхность инфарктного бьющегося сердца. В итоге проводится эхокардиография для оценки функции сердца и гистологический анализ для измерения размера инфаркта.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как стернотомия, является то, что это малоинвазивный подход, демонстрирующий, что процедура будет выполнена И. Лопесом и сотрудниками нашей лаборатории. Все животные содержались и использовались в соответствии с рекомендациями FELASA и Законом Швейцарии о защите животных. После обескровливания крысы, выделения и очистки бедренных костей согласно текстовому протоколу, с помощью ножниц отсеките оба конца костей.

Затем для вымывания костного мозга введите стерильный PBS в костномозговой канал и соберите костный мозг в пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте собранный костный мозг в течение семи минут при 300 ×g. Удалите супернадант и добавьте три миллилитра буфера для лизиса эритроцитов. Ресуспендируйте осадок, инкубируйте суспензию в течение одной минуты при комнатной температуре, после чего повторно центрифугируйте в течение семи минут при 300 ×g.

Ресуспендирование осадка в стерильной культуральной среде. Добавьте дополнительную культуральную среду в культуральный флакон объемом 150 мл и проведите пересев клеток на второй день инкубации. Замените среду, чтобы удалить неадгезивные клетки, и продолжайте заменять среду каждые два дня в течение двух-трех недель до достижения желаемой плотности клеток.

Для проведения первой Т-торакотомии начните с взвешивания крысы и соответствующей настройки параметров аппарата ИВЛ. Выдох при вентиляции определяется автоматически. Затем выбрейте шерсть на левой части грудной клетки, включите нагревательный коврик и установите температуру 37 °C.

После проведения анестезии крысы согласно текстовому протоколу, выполните щипковый тест за палец или хвост, затем поместите животное на heating pad в положение на спине. С помощью внутривенного катетера 14G проведите интубацию животного, после чего подсоедините интубационный катетер к вентилятору для грызунов. Установите следующие параметры: подача кислорода 2,5 liters per minute, концентрация isof fluorine 2,5%, дыхательный объем 2 milliliters и частота дыхания 90 breaths per minute. Подготовьте шприц с бупренорфином в дозе 0,1 milligrams per kilogram для подкожного введения, введите одну треть раствора, затем продезинфицируйте область инъекции 1% Betadine solution.

Затем сделайте разрез кожи перпендикулярно грудине на уровне четвертого межреберного промежутка и разделите три слоя грудных мышц. После этого вскройте четвертый межреберный промежуток между четвертым и пятым ребром. Используйте небольшой ретрактор, чтобы раздвинуть ребра и обнажить сердце.

Затем осторожно вскройте перикард, найдите левую переднюю нисходящую коронарную артерию (LAD) и с помощью шовного материала 7.0 перевяжите ее на четыре миллиметра ниже предсердия. После этого проконтролируйте изменение цвета ишемизированной области, используя нити 3-0, расположенные примерно дистальнее грудины. Наложите два шва, которые будут использованы для закрытия межреберного пространства.

Затяните дистальный шов. Пережмите выпускную трубку вентилятора на две секунды, чтобы раздуть грудную клетку и избежать пневмоторакса. Затем затяните второй шов.

Верните мышечные слои в исходное положение. Затем с помощью шовного материала нулевого размера зашейте кожу, используя 1% раствор Betadine. Продезинфицируйте область шва и введите оставшийся раствор бупренорфина.

Выключите систему анестезии и извлеките интубационный катетер. Поместите крысу в клетку под теплую лампу на один-два часа, прежде чем вернуть животное в установку для содержания в индивидуальных клетках (IVC). Через две недели после первой торакотомии заживление завершается, и рубец становится едва заметен.

Следуя процедуре подготовки крысы к операции, описанной ранее в этом видео, сделайте разрез кожи перпендикулярно грудине на уровне пятого межреберного промежутка. Разделите три слоя мышц и раскройте пятый межреберный промежуток между пятым и шестым ребрами. Используйте небольшой ретрактор, чтобы раздвинуть ребра и обнажить сердце.

Если наблюдаются спайки, осторожно удалите их с помощью тонкого пинцета. Затем найдите область инфаркта, которая выглядит как бледная зона ниже места наложения лигатуры. При необходимости введите в верхушку отрезок шовного материала 7-0 длиной 10 сантиметров и осторожно потяните за него, чтобы лучше визуализировать левый желудочек.

Затем нанесите клетки и матрикс на поверхность ишемизированного участка сердца. После центрифугирования и получения осадка из 4 × 10⁶ клеток, как описано в текстовом протоколе, поместите осадок на сердце, после чего покройте его фибриновым клеем. Слой клея фиксирует клетки на поверхности сердца.

После удаления шовного материала из верхушечного положения, слои мышц зашивают на место, после чего животное дезинфицируют. Как демонстрировалось ранее в видео, показанном здесь. После хирургического вмешательства животные теряли в весе и быстро восстанавливались, прежде чем начать набирать вес независимо от примененного лечения. Как показано на этом графике Каплана, выживаемость после первой торакотомии высокая; у животных, которым вводили фибрин и/или клетки, наблюдалась более низкая выживаемость по сравнению с другими группами, что видно на данном графике.

Тем не менее, общие показатели выживаемости оставались высокими после повторной торакотомии и лечения. Функцию сердца оценивали с помощью эхокардиографии. Эти репрезентативные изображения в режиме M для здоровых животных и животных с инфарктом иллюстрируют, что сократимость стенки ЛЖ полностью отсутствует через две недели после перевязки LAD; фракционное сокращение было зарегистрировано через две недели после перевязки LAD в общей сложности у 104 животных.

Распределение частот демонстрирует достаточно воспроизводимые методы с коэффициентом вариации 17%. На данном рисунке представлено графическое отображение функции сердца по измеренной фракции выброса через две и шесть недель после лигирования левой передней нисходящей артерии (ЛПНА). В этот период функция сердца продолжает снижаться. В течение этого же времени происходит ремоделирование сердца, что здесь представлено увеличением объемов левого желудочка (ЛЖ), зафиксированным как в систоле, так и в диастоле. Наконец, окрашивание срезов сердца золотым красителем показало, что к шести неделям после лигирования ЛПНА развилась фиброзная ткань и, в конечном итоге, трансмуральный рубец. После освоения эта методика может быть выполнена за 30–40 минут при условии правильного проведения процедуры.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнить малоинвазивную двойную торакотомию.