Клеточная терапия для сердечной недостаточности у крыс: Двухместный Торакотомия для инфаркта миокарда и эпикарда Имплантация клеток и Biomatrix

Целью этой процедуры является проведение двойной торакотомии на крысах с целью проведения коронарного лигирования и эпикардиального наложения. Это достигается путем предварительного выполнения торакотомии в четвертом межреберье. Далее перевязывается левая передняя нисходящая коронарная артерия или ПМЖ

Затем через две недели проводится вторая торакотомия в пятом межреберье. Наконец, клетки и матрикс наносятся на поверхность инфарктированного бьющегося сердца. В конечном счете, эхокардиография проводится для оценки функции сердца, а гистология проводится путем измерения размера инфаркта.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как стернотомия, заключается в том, что это минимально инвазивный подход, демонстрирующий, что процедура будет и не была отправлена сотрудниками из нашей лаборатории. Все животные были обработаны в соответствии с рекомендациями F-E-L-A-S-A и Швейцарского закона о защите животных. После обескровливания крысы и изоляции и очистки бедренных костей в соответствии с текстовым протоколом, с помощью ножниц разрезайте оба кончика костей.

Затем для промывания костного мозга введите стерильный PBS в ядро кости, а костный мозг соберите в 15-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте собранный костный мозг в течение семи минут при 300-кратной Г. Удалите супинат с помощью трех миллилитров буфера для лизиса эритроцитов. Суспензируйте гранулу, выдержите суспензию в течение одной минуты при комнатной температуре, а затем снова вращайте в течение семи минут при 300-кратном перегрузке после рессуса.

Суспензирование гранулы в стерильной питательной среде. Добавьте дополнительную среду для культивирования клеток в колбу для культур объемом 150 мл и высейте клетки на второй день инкубации. Меняйте среду для удаления неадгезивных клеток и продолжайте заменять среду через день в течение двух-трех недель до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток.

Чтобы провести первую Т-торакотомию, начните с взвешивания крысы и настройте соответствующие параметры аппарата ИВЛ. Вентиляционный отток определяется автоматически. Затем побрейте левую часть грудной клетки, включите грелку и установите ее на 37 градусов по Цельсию.

После обезболивания крысы согласно текстовому протоколу выполните ущипывание пальца ноги или хвоста перед размещением крысы на грелке в лежачем положении с помощью внутривенного катетера 14 калибра, интубируйте животное, затем подключите интубационный катетер к аппарату искусственной вентиляции легких грызунов. Запрограммирован на 2,5 литра кислорода в минуту, 2,5% фтора, дыхательный объем два миллилитра и частоту дыхания 90 вдохов в минуту. После приготовления шприца с бупренорфином 0,1 миллиграмма на килограмм подкожно вводят одну треть раствора, затем используют 1% раствор бетадина для дезинфекции участка.

Далее надрежьте кожу перпендикулярно грудине четвертого межреберья и отделите три слоя грудной мышцы. Затем откройте четвертое межреберье между четвертыми и пятью ребрами. Используйте небольшой ретрактор, чтобы раздвинуть ребра и обнажить сердце.

Затем осторожно откройте перикард и найдите левую переднюю нисходящую коронарную артерию или ПМЖ и с помощью шва 7,0 перевязать ее на четыре миллиметра ниже предсердия. Затем контролируйте изменение цвета ишемизированной области с помощью трех нулевых швов, расположенных приблизительно и дистально от грудины. Сделайте два стежка, которые будут использоваться для закрытия межреберья.

Затяните дистальный шов. Зажмите вытяжную трубку аппарата ИВЛ на две секунды, чтобы надуть грудную клетку и избежать пневмоторакса. Затем затяните второй шов.

Верните мышечные слои на место. Затем с помощью пяти нулевых швов закрыть кожу 1%-ным раствором бетадина. Продезинфицируйте шов и введите оставшийся раствор бупренорфина.

Выключите систему анестезии и снимите интубационный катетер. Подержите крысу в клетке под теплой лампой в течение одного-двух часов, прежде чем вернуть ее в отделение НПВ. Через две недели после первой торакотомии заживление завершено, и шрам едва заметен.

Следуя процедуре, описанной ранее в этом видео для подготовки крысы к операции, сделайте надрез кожи перпендикулярно грудине в пятом межреберье. Отделите три слоя мышц и откройте пятое межреберье между пятью и шестью ребрами. Используйте небольшой ретрактор, чтобы раздвинуть ребра и обнажить сердце.

Если есть некоторое прилипание, используйте тонкие щипцы, чтобы осторожно его снять. Затем найдите область инфаркта, которая выглядит как бледная область ниже лигатуры. При необходимости вставьте 10-сантиметровый кусочек семинулевого шва на вершине и аккуратно потяните за него, чтобы лучше визуализировать левый желудочек.

Затем нанести клетки и матрикс на поверхность ишемизированного участка сердца. После гранулирования, четыре раза по 10 к шести клеткам, как указано в текстовом протоколе, нанесите палитру на сердце, прежде чем использовать фибриновый герметик для его покрытия. Слой клея фиксирует клетки на поверхности сердца.

После снятия куска шва с верхушечного положения, мышечные слои обратно на место накладывают шов и дезинфицируют животное. Как показано ранее в видео, как показано здесь. Как показано на этом графике Каплана, выживаемость высока после первой Т-торакотомии, животные, получавшие фибрин и/или клетки, продемонстрировали более низкие показатели выживаемости, чем другие группы, как показано на этом графике.

Тем не менее, общая выживаемость оставалась высокой уже через секунду. Торакотомию и лечение функции сердца оценивали с помощью эхокардиографии. Эти репрезентативные изображения в режиме М для здоровых и инфарктированных животных иллюстрируют, что сократительная способность стенки ЛЖ исчезает через две недели после лигирования ПМЖ фракционное укорочение через две недели после лигирования ПМЖ было зарегистрировано в общей сложности у 104 животных.

Распределение частот показывает достаточно воспроизводимые методы с коэффициентом вариации 17%На этом рисунке изображено графическое представление функции сердца по измеренной фракции выброса через две и шесть недель после ПМЖ Функция сердца продолжает снижаться в течение этого периода времени. Ремоделирование сердца также происходит в этот период и представлено здесь увеличением объемов ЛЖ, зарегистрированных как в сестринском, так и в диастолном диапазоне. Наконец, золотое окрашивание на срезах сердца показало, что фиброзная ткань и, в конечном итоге, трансмуральный рубец развились через шесть недель после лигирования ПМЖ После освоения этой техники ее можно выполнить за 30-40 минут, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить малоинвазивную двойную торакотомию.