ЛУЧШИЙ: Штрих Enabled Секвенирование тетрад

Общая цель данной процедуры заключается в создании большого количества рекомбинантного потомства в результате скрещивания дрожжей таким образом, чтобы сохранилась информация о том, какие потомки были получены из одной и той же исходной тетрады. Это достигается путем предварительной трансформации гетерозиготного диплоидного штамма, используемого в скрещивании, библиотекой плазмид, которая содержит тетра-специфичный штрихкод и флуоресцентный репортер, специфичный для споруляции. Вторым этапом является перенос маркированных штрихкодом клеток в среду для споруляции.

Это позволяет формироваться тетрадам и индуцирует экспрессию флуоресцентного репортера GFP в тетрадах, но не в клетках, которые не подверглись споруляции. Затем с помощью FACS-сортировщика флуоресцентно помеченные тетрады отделяют от остальных клеток и переносят непосредственно на чашку с агаром, где внешняя оболочка тетрад подвергается ферментативному расщеплению. Заключительным этапом является использование стеклянных шариков для разделения и распределения спор расщепленных тетрад по поверхности агарной среды, что позволяет каждой споре образовать отдельную колонию.

В конечном итоге полученные с помощью этого метода штаммы будут генотипированы с использованием протокола высокопроизводительного мультиплексного секвенирования ДНК для считывания тетра-специфичного штрихкода каждого штамма. Затем штрихкоды используются для идентификации каждого из четырех штаммов, возникших в результате одного миотического события. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как ручное микродиссекирование с использованием микроманипулятора, является то, что один исследователь может изолировать несколько тысяч рекомбинантных потомков всего за несколько часов.

Диплоидные дрожжевые клетки, использованные в данном исследовании, были предварительно трансформированы библиотекой баркодированных плазмид, как описано в сопроводительной рукописи, и хранились при температуре -80 °C для последующего восстановления клеток из замороженных стоков. На следующий день культивируйте их в течение ночи в 5 мл среды YPD с добавлением 200 мкг/мл G418 при 30 °C с перемешиванием. Промойте клетки из ночных культур трижды в PBS, а затем ресуспендируйте их до конечного объема 2 мл в среде для споруляции с добавлением 200 мкг/мл.

Перемешивайте культуры при споруляции при комнатной температуре. Ежедневно контролируйте ход споруляции до тех пор, пока не прекратится формирование новых тетрад. Обычно это занимает от двух до четырех дней после того, как в культурах появятся хорошо сформированные тетрады и относительно малое количество диад.

Снимите культуры с встряхивания и оставьте при комнатной температуре минимум на семь дней перед сортировкой тетрад. Самым сложным аспектом данной процедуры является достижение качественного разделения спор. Эмпирически было установлено, что выдерживание спорулирующих культур при комнатной температуре без встряхивания в течение как минимум одной недели перед сортировкой тетрад значительно улучшает разделение спор.

Тетрады из культуры споруляции можно обнаружить и изолировать с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACS), так как штрих-кодированные плазмиды в диплоидных клетках также несут специфический для споруляции слитый белок GFP. Описанный здесь протокол был разработан для FACS Aria II. Чтобы начать эту процедуру, поместите спорулированную культуру в сортер FACS и настройте два гейта прямого и бокового светорассеяния, чтобы исключить клеточный дебрис, агрегаты клеток и наличие нескольких клеток в одной капле.

Должна присутствовать популяция флуоресцентных клеток; при использовании репортерной конструкции GFP PS two она включает диады и тетрады. Установите гейт по параметрам GFP и FSC, чтобы выделить эти флуоресцентные события. В зависимости от генетического фона штамма может потребоваться дополнительный гейт для удаления агрегатов, состоящих из тетрад и других клеток. Проанализируйте гистограмму FSC для флуоресцентных событий.

В данном примере события в левом пике представляют собой преимущественно тетрады, а события в правом пике — в основном тетрады с прикрепленной почкой; примените финальный гейт, который включает события с более низким FSC, являющиеся преимущественно тетрадами, что обозначено красными полосами. Проверьте эффективность режима гейтирования, отсортировав примерно 1 500 тетрад на предметное стекло и подсчитав соотношение тетрад и нететрад. С помощью фазово-контрастного микроскопа при 400-кратном увеличении процент тетрад можно точно оценить, подсчитав всего около 200 отсортированных событий, однако сортировка примерно 1 500 событий сокращает время, затрачиваемое на поиск клеток на предметном стекле.

Эти изображения в светлом поле получены при 600-кратном увеличении. Слева представлены примеры тетрад, а справа — объектов, не являющихся тетрадами, после проведения сортировки. Периодически проверяйте точность подсчета событий сортером, отбирая 25 тетрад на предметное стекло и исследуя клетки в капле с помощью фазово-контрастного микроскопа при 400-кратном увеличении.

В капле должно находиться 25 тетрад. Повторите процедуру три или четыре раза, чтобы оценить вариабельность прибора FACS в данном цикле. Подготовьте агариковые пластины для этой процедуры, предварительно прогрев необходимое количество чашек с YPD плюс G 4 в течение не менее 1,5 часов в инкубаторе при 37 °C, расположенном рядом с сортером FACS.

Ключевой особенностью протокола сортировки является возможность точного направления тетрад, отсортированных методом FACS, в определенное место на чашке с агаром, содержащей пул раствора X. Для этого сначала установите ориентир в виде 96-луночного планшета на автоматический блок осаждения клеток сортера. Затем подготовьте схему сортировки, которая позволит распределить 25 тетрад в одну лунку 96-луночного планшета.

Сортировка по 25 тетрадов на лунку обеспечивает хорошее разделение колоний. Выберите лунку ближе к центру планшета. Например, лунку D5.

Перенесите стопку из 10 чашек с агаром из инкубатора при 37 °C к сортеру. Возьмите одну чашку с агаром и пипеткой нанесите 25 µl раствора zy на агар в области центра чашки. Затем поместите чашку на ориентировочный 96-луночный планшет, совместив каплю X с целью.

Этот образец был выбран ранее. Итак, D5. Запустите сортировку и перенесите 25 тетраплоидов в центр капли zy на чашке с агаром.

Снимите и накройте планшет. Повторите сортировку для каждого планшета до тех пор, пока на каждом планшете в стопке не будет отсортировано по 25 тетрад в капли zamo. Верните стопку планшетов, содержащих тетрады, в инкубатор при температуре 37 °C.

Поднесите следующую стопку из 10 чашек к сортировщику и повторите процедуру сортировки. Споры можно отделять после того, как чашки с агаром, содержащие тетрады, будут инкубированы при 37 °C в течение 1,5 часов. Чтобы начать эту процедуру, добавьте в каждую чашку от 15 до 25 стерильных стеклянных шариков диаметром 3 мм и встряхивайте чашки, разделенные на две стопки по пять штук, в течение трех-пяти минут.

Наилучшее разделение спор достигается путем перемещения планшетов строго из стороны в сторону или вперед-назад. Не перемещайте планшеты так, чтобы шарики закручивались по внешнему краю. После завершения процедуры оставьте шарики в планшетах.

Поместите стопку чашек с бусинами лицевой стороной вверх в инкубатор при 30 °C. Извлеките следующую стопку чашек из инкубатора при 37 °C и повторите процедуру отделения спор с использованием бусин. На следующий день после отделения спор инкубируйте все чашки в течение ночи при 30 °C.

Осторожно извлеките чашки из инкубатора, настроенного на 30 °C, стараясь не задеть стеклянные шарики. На чашках должны были образоваться мелкие колонии. Удалите стеклянные шарики, осторожно и быстро перевернув чашки над глубоким контейнером.

Постукивание по дну перевернутой чашки может помочь отделить прилипшие к ней бусины. Контейнеры должны быть достаточно глубокими, чтобы собрать бусины и предотвратить их отскок и соприкосновение с агарной чашкой. Подсчитайте количество колоний на каждой чашке и используйте это число для оценки эффективности разделения и извлечения спор.

Например, 25 тетрад на чашку при жизнеспособности, близкой к 100%, могут дать в общей сложности 100 колоний на чашку; для высокой жизнеспособности достаточное количество колоний составляет более 65. Перенесите клетки из каждой колонии в отдельную лунку 96-луночного планшета, содержащего жидкую среду YPD с добавлением G four 18. Также отметьте, в каких лунках находятся колонии с одной и той же агаризованной среды.

Эта информация будет использована в дальнейшем для облегчения назначения тетрад. Специализированное программное обеспечение позволяет значительно увеличить скорость изоляции спор из тетрад. Несмотря на то, что текущая итерация метода характеризуется некоторым снижением эффективности по сравнению с ручным препарированием, для расчета ожидаемой доли тетрад, в которых успешно удалось выделить хотя бы одну спору, образовавшую 1, 2, 3 или четыре колонии, использовалось биномимальное распределение, основанное на доле всех успешно выделенных спор.

Этот график может служить приблизительным ориентиром по количеству штаммов, которые в конечном итоге будут собраны в три или четыре споровые тетрады, как показано здесь. Количество выделенных полных тетрад увеличивается по мере увеличения числа колоний на чашке в данном исследовании. 25 рад от перекрестного облучения при жизнеспособности спор, близкой к 100% (определенной путем ручного диссекирования), были высеяны на 149 чашки с агаром.

Максимальное количество колоний, наблюдаемое на одной чашке, составило 80, что указывает на то, что 20 спор не смогли образовать отдельные колонии. Среднее количество колоний на чашке составило 62. Было собрано и секвенировано 4 354 колонии с 61 чашки, содержащей 65 или более колоний. Из 3 700 штаммов, прошедших контроль качества секвенирования, 2 665 или 72% удалось вычислительно распределить по трем или четырем споровым тетрадам после освоения метода.

Данный метод позволяет обрабатывать более тысячи тетрад в час. Однако при продолжительности процедур более трех часов вам потребуется помощь.