Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Общая цель этой процедуры заключается в профилировании уровней экспрессии генов отдельных эмбриональных стволовых клеток человека с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией одной клетки, или R-T-P-C-R. Это достигается путем сортировки флуоресцентных активированных клеток для сортировки отдельных клеток в каждой лунке 96-луночного планшета, содержащего буфер для лизиса клеток. Вторым шагом является обратная транскрибация РНК для получения CDNA из лизатов одиночных клеток.

Затем CDNA амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции. Заключительным этапом является количественное выполнение R-T-P-C-R на амплифицированной CDNA. В конечном счете, этот анализ полезен для изучения экспрессии генов в гетерогенных популяциях, таких как эмбриональные стволовые клетки человека.

Основным преимуществом данной методики перед существующими одноклеточными количественными искусственными сосудами является то, что данный метод ЭЭГ и более надежен до обработки факса. Четыре человеческие эмбриональные стволовые клетки ОКТ EGFP или Hess отделяются от 60-миллиметровой чашки. Удалите всю среду, добавьте один миллилитр Аккутана и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

Нейтрализуйте Аккутан с помощью одного миллилитра человеческой ЭС-центрифуги, чтобы гранулировать клетки после удаления надосадочной жидкости, ресуспендировать клетки в факс-буфере и отрегулируйте концентрацию от одного до 10 до шести клеток на миллилитр. Затем пропустите образец клетки через пробирку с крышкой сетчатого фильтра размером 35 микрометров. Храните пробирку на льду перед сортировкой клеток.

Начните эту процедуру с приготовления мастер-смеси, содержащей один микролитр одноклеточного D, N, один и девять микролитров раствора для лизиса одной клетки. Для каждой лунки хорошо переносят 10 микролитров раствора смеси в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета для факсимильного анализа программы, сортировщик клеток сортирует одиночные EGFP-положительные клетки в лунки 96-луночного ПЦР-планшета после сортировки клеток, инкубируют образцы в течение пяти минут при комнатной температуре для лизиса клеток. Чтобы остановить реакцию лизиса, добавьте один микролитр стоп-раствора и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух минут.

Чтобы начать эту процедуру, сначала добавьте в каждую лунку из 96 лунок 0,5 микролитра Eloqua из 20 микромоляров SMAT 15 и SMAA. Нагрейте образцы до 80 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте четыре микролитра пяти x буфера, два микролитра DTT, один микролитр обратной транскриптазы и один микролитр D и tps.

Чтобы каждая скважина выполняла обратную транскрипцию в термоамплификаторе. Установите тепловую программу на уровне 42 градусов Цельсия на 90 минут, а затем на 85 градусов Цельсия на пять минут. Чтобы инактивировать обратную транскриптазу после завершения обратной транскрипции, добавьте четыре микролитра экзореагента в каждый образец CDNA, инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут, чтобы переварить избыточные олигонуклеотиды, а затем 80 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Чтобы инактивировать экзореагент, приготовьте реакционную смесь для ПЦР с двумя наномолярами двух праймеров SMAP two. Добавьте 10 микролитров реакционной смеси для ПЦР. К каждой обратной транскрибируется выборка.

Проводят амплификацию, состоящую из 20 циклов денатурации, опускания на колени и удлинения после амплификации образцов выполняют два набора количественных R-T-P-C-R реакций в отдельных планшетах для подтверждения результатов R-T-P-C-R в каждую лунку из 2 96 лунок добавляют по 10 микролитров двух х кибер-зеленых. Мастер ПЦР смешать один микролитр амплифицированной КДНК, два праймера и семь микролитров воды. Установите программу на 95 градусов Цельсия на три секунды, а затем на 60 градусов Цельсия на 30 секунд.

В течение 40 циклов ступенька на колене удаляется, чтобы уменьшить погрешность праймера. В этом исследовании микрограммовые количества общей РНК Гесса были разбавлены до нано- и пикограмм-уровней для оценки технической вариабельности, а обнаружение различий на низких количествах общего количества РНК R-T-P-C-R гена G-A-P-D-H было выполнено с помощью МРТ. НК объединенной шелухи серийно разбавляется от 10 нанограмм на микролитр до 0,1 пикограмм на микролитр. Каждая точка показывает значение CT серийно разведенной мРНК и одноклеточной мРНК, отсортированных по факсу.

Корреляция наблюдалась между каждым образцом и результатами QR TPCR с несколькими отдельными клетками, показывающими схожие значения КТ. Факс использовался для сортировки и отбора сильных ЭЭГ FP-положительных клеток из линии ОКТ с четырьмя EGFP репортерами HESC. Результаты показывают, что EGFP-положительная популяция составляет примерно 60% по сравнению с отрицательной популяцией, что подтверждает согласованность между различными партиями реакций обратной транскрипции и амплификации.

Очищенные по факсу лизаты одиночных клеток были разделены на две части, и протокол применялся к каждой половине для сравнения партий. Наблюдалась достоверная корреляция между значением КТ ОКТ-4 каждой половины лизатов одиночных клеток. Представление экспрессии гена одной оболочки на тепловой карте показывает постоянный и устойчивый уровень экспрессии OCT-4, но различные уровни другого маркера стволовых клеток, NAN og, взятые вместе, показывают, что этот анализ экспрессии гена одной клетки полезен для изучения популяционных гетерогенностей плюрипотентных стволовых клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как правильно выполнять QITP для одноклеточного транскриптома.