Нейтрофилов человека Проточная камера Адгезия Анализ

Общая цель данной процедуры — измерение прочной адгезии нейтрофилов с помощью анализа в проточной камере, который позволяет изучать адгезию нейтрофилов человека в условиях напряжения сдвига. Это достигается путем предварительной подготовки субстрата из очищенных молекул адгезии или поверхности эндотелиальных клеток, таких как эндотелиальные клетки пупочной вены человека или ve. На втором этапе нейтрофилы отделяют от периферической крови человека, используя метод двухслойного центрифугирования с применением PHI call.

Затем собирается потоковая камера для введения выделенных нейтрофилов человека под воздействием напряжения сдвига на подложку с адгезивноми молекулами, лигандами или ve. Заключительный этап заключается в регистрации событий адгезии нейтрофилов в потоковой камере с последующим тщательным количественным определением прочной адгезии. В конечном счете, анализ в потоковой камере используется для демонстрации прочной адгезии нейтрофилов к очищенным адгезивным молекулам и поверхности HX.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аутоиммунных заболеваний, такие как функциональная значимость генетических вариаций молекул тканей, которые, как известно, связаны с развитием аутоиммунитета. Генетические исследования пациентов с системной красной волчанкой продемонстрировали сильную связь с вариантами бета-2-интегрина, белка, участвующего в прочной адгезии нейтрофилов. Мы разработали эту систему анализа для оценки функциональных последствий генетической вариации в этом бета-2-интегрине, называемом Mac-1, при прочной адгезии. Подготовьте культуральные чашки для использования в проточной камере.

Добавьте по 1 мл раствора фибрина и желатина в каждую чашку для культивирования тканей диаметром 35 мм и несколько раз перемешайте с помощью пипетки, чтобы поверхность всей чашки была равномерно покрыта. Удалите избыток раствора фибронектина и желатина и высушите чашки на воздухе в течение как минимум 30 минут. Для оптимизации формирования белкового матрикса соберите эндотелиальные клетки пупочной вены человека или qve, выращенные до 80–90% конфлюэнтности, используя трипсин-ЭДТА, и посейте по 500 000 клеток в каждую подготовленную чашку для культивирования тканей.

Добавьте по два миллилитра ростовой среды в каждую чашку и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2. Состояние клеток следует проверять ежедневно, заменяя среду каждые два дня. Дождитесь, пока клетки достигнут 80–90% конфлюэнтности.

Для начала данной процедуры с помощью маркера или ручки нарисуйте круг диаметром 0.5 сантиметра в центре чашки для культивирования тканей диаметром 35 миллиметров. В отмеченную область нанесите 20 µL раствора белка A с концентрацией 20 µg/mL. С помощью наконечника пипетки распределите раствор белка A так, чтобы он полностью покрыл область внутри круга диаметром 0.5 сантиметра.

Важно не касаться и не царапать поверхность чашки. Инкубируйте чашки для культивирования тканей при 37 °C в течение одного часа. Затем трижды промойте каждую планшетку, покрытую белком, 1 мл PBS.

После удаления PBS из третьей промывочной пластины в отмеченной области нанесите 50 µL 1% BSA для блокирования неспецифического связывания на пластине. Инкубируйте при температуре четыре °C в течение двух часов. Через два часа.

Трижды промойте блокированную планшетку одним миллилитром PBS. Подготовьте растворы химерных белков-лигандов рецепторов адгезии FC для покрытия и данного эксперимента: будут использованы ICAM one FC Kyra в концентрации 25 µg/mL и P selectin FC Kyra в концентрации 0.5 µg/mL. Покройте отмеченную область 50 µL субстрата, инкубируйте чашки для культивирования тканей в течение ночи при 4 °C.

Чашки следует использовать в течение двух дней, не допуская высыхания поверхности с нанесенным покрытием. При необходимости добавьте PBS, чтобы поддерживать объем раствора на планшете в количестве 50 µL.

Нейтрофилы для данного исследования выделяют из крови участников, предоставивших письменное информированное согласие. После забора крови методом флеботомии в пробирку для сбора крови с антикоагулянтом или вакутайнер, разбавьте кровь в соотношении один к одному с PBS перед выполнением всех этапов данной процедуры. При комнатной температуре подготовьте двухслойный раствор Ficoll для разделения мононуклеарных клеток периферической крови (МНК) и нейтрофилов в центрифужных пробирках объемом 50 мл.

Сначала добавьте 15 миллилитров тяжелого PHI call, а затем осторожно наслаивайте 10 миллилитров легкого fi call поверх тяжелого fi call. Между слоями легкого fi call и тяжелого fi call должна образоваться четкая граница. Наконец, осторожно наслаивайте 25 миллилитров разбавленного образца крови поверх легкого fi call, не нарушая слой PHI.

Центрифугируйте пробирки для разделения на слои в течение 30 минут при комнатной температуре; после центрифугирования должно образоваться несколько слоев. Слой нейтрофилов с небольшим количеством эритроцитов находится между легкой и тяжелой фазами. Аккуратно соберите слой нейтрофилов с помощью переносной пипетки, перенесите его в новую пробирку объемом 50 мл и добавьте PBS до конечного объема 50 мл.

Центрифугируйте при 225 ×g в течение 10 минут. После центрифугирования при комнатной температуре в смеси с нейтрофилами могут все еще присутствовать эритроциты. Аспирируйте супернатант до уровня 10 мл.

Маркируйте пробирку Resus. Ресуспендируйте осадок нейтрофилов и эритроцитов, кратковременно перемешав на вортексе на низкой скорости, затем повторно промойте 50 миллилитрами PBS; аспирируйте супернатант, чтобы удалить contaminating red blood cells. Ресуспендируйте осажденные клетки в остатках PBS, кратковременно перемешав на вортексе на низкой скорости.

Добавьте 25 миллилитров воды и осторожно перемешайте на вортексе в течение 10 секунд. Для лизиса эритроцитов добавьте 25 миллилитров 1.8% раствора хлорида натрия и немедленно перемешайте путем центрифугирования при 225 ×g в течение 10 минут.

Теперь необходимо провести лизис contaminating эритроцитов, чтобы в результате остался осадок белых нейтрофильных клеток. Промойте осадок нейтрофилов PBS, удалите супернатант и ресуспендируйте изолированные нейтрофилы в среде RPMI с 10% FBS. После определения концентрации клеток под световым микроскопом с помощью гемоцитометра доведите плотность клеток до 500,000 клеток на миллилитр, используя полную среду RPMI с 10% FBS.

Перед началом анализа адгезии в проточной камере предварительно обработайте VE 20 ng/mL человеческого TNF alpha в течение четырех-шести часов для ап-регуляции и стимуляции экспрессии молекул адгезии. Когда VE будут готовы, соберите проточную камеру. Поместите чашку диаметром 35 мм с конфлюэнтным слоем VE на предметный столик микроскопа.

В данном видео будет рассмотрена только адгезия нейтрофилов к VE, однако та же процедура применима для изучения адгезии нейтрофилов к очищенным молекулам адгезии. Подключите камеру с параллельными пластинами к шприцевому насосу и вакуумной системе, оставив одну линию открытой для ввода нейтрофилов. Установите камеру потока поверх пластины и закрепите узел камеры потока. Запустите программу видеозаписи на компьютере, подключенном к микроскопу.

Отрегулируйте поле зрения и фокус микроскопа до появления четкого изображения с полностью сформированной VE. С помощью шприцевого насоса промойте проточную камеру средой RPMI. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха внутри камеры или в линии подачи нейтрофилов.

Используйте шприцевой насос для введения нейтрофилов в проточную камеру с заданной скоростью. Запишите видео, так как адгезия нейтрофилов может произойти быстро; для количественного анализа событий адгезии обычно достаточно видеозаписи продолжительностью от четырех до пяти минут. В данном видеоклипе показан пример связывания нейтрофилов с проточной камерой, покрытой HU E.

Адгезивной клеткой считается клетка, которая перемещается на расстояние менее одного клеточного диаметра в течение пяти секунд на поверхности, покрытой HU e. Здесь представлены скриншоты из образцов видеозаписей в разные моменты времени, демонстрирующие адгезию нейтрофилов к поверхности, покрытой ICAM 1, P-селектином или uve.

В обоих экспериментах скорость потока нейтрофилов составляет 350 µL/min при плотности нейтрофилов 500 000 клеток/mL. В типичных условиях наблюдалось, что от 50 до 70 нейтрофилов человека прочно прикреплялись к поверхности, покрытой лигандом или VE, в течение четырехминутного периода записи. Однако аллельные варианты молекул адгезии нейтрофилов или аллельные варианты в субстрате могли существенно изменить количественную адгезию нейтрофилов, что подтверждается записью видео аналогичной продолжительности с разными донорами.

Для нейтрофилов можно рассчитать количество прикрепившихся клеток в минуту, чтобы сравнить адгезивные свойства образцов от разных доноров. При выполнении этой процедуры важно визуально проверить нейтрофилы на наличие агрегации клеток, вызванной активацией в процессе выделения. Кроме того, можно провести параллельный анализ активации клеток методом проточной цитометрии, чтобы убедиться в соответствии состояния активации клеток между донорами и в разных экспериментах.

Этот метод открыл исследователям в области аутоиммунитета возможность изучать адгезию клеток в первичных клетках человека от доноров с различными аллелями кодирующей области цепи CD 11 B бета-2-интегрина MAC-1. Эти исследования позволили провести тщательную количественную оценку функционального влияния данных аллельных вариантов в системе человека.