Нейтрофилов человека Проточная камера Адгезия Анализ

Способ количественного нейтрофилов адгезию сообщается. Этот метод создает динамическую среду потока аналогичной той, что встречается в кровеносном сосуде. Это позволяет исследование нейтрофилов адгезии к или очищенных молекул адгезии (лиганда) или эндотелиальных клеток подложки (HUVEC) в контексте подобной окружающей среды в естественных условиях с чистой стресса.

Общая цель этой процедуры заключается в измерении прочной адгезии нейтрофилов с помощью проточной камеры, которая позволяет определить адгезию нейтрофилов человека в присутствии напряжения сдвига. Это достигается путем предварительного приготовления субстрата из очищенных молекул адгезии или поверхности эндотелиальных клеток, таких как пупочная вена человека, эндотелиальные клетки или ve. Второй шаг заключается в отделении нейтрофилов от периферической крови человека с помощью двухслойного метода центрифугирования PHI.

Затем собирается проточная камера, позволяющая впрыскивать изолированные нейтрофилы человека под действием напряжения сдвига на подложку адгезии, лигандов или ve. Заключительным этапом является регистрация событий адгезии нейтрофилов в проточной камере с последующим тщательным количественным определением твердой адгезии. В конечном счете, анализ в проточной камере используется для демонстрации прочной адгезии нейтрофилов к очищенным молекулам адгезии и поверхности HX.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аутоиммунных заболеваний, такие как функциональная важность генетических вариаций в молекулах ткани, которые, как известно, связаны с развитием аутоиммунных заболеваний. Генетические исследования у пациентов с системной красной волчанкой птозом продемонстрировали сильную связь с вариантами и интегрином Abeta-2, белком, участвующим в адгезии нейтрофилов. Мы разработали эту систему анализа для оценки функциональных последствий генетической изменчивости в этом бета-двойном эндокринном компоненте, называемом Мак уан, на твердую адгезию Для подготовки питательных чашек для использования в проточной камере.

Добавьте по одному миллилитру раствора фибрина и желатина в каждую 35-миллиметровую чашку для культуры тканей и пипетку несколько раз, чтобы убедиться, что вся поверхность пластины покрыта. Удалите излишки фибронектина и желатинового раствора и высушите пластины на воздухе не менее 30 минут. Чтобы оптимизировать формирование белкового матрикса, соберите эндотелиальные клетки пупочной вены человека или qve, которые были культивированы до 80-90% конфлюенции с использованием семян трипсина ЭДТА 500 000 клеток, в каждую покрытую оболочкой чашку для культуры тканей.

Добавьте по два миллилитра питательной среды в каждое блюдо и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия. 5%-ные клетки CO2 следует визуально осматривать ежедневно, меняя среду каждые два дня. Позвольте клеткам вырасти до 80–90% конфлюенции.

Чтобы начать эту процедуру, с помощью маркера или ручки нарисуйте круг диаметром 0,5 сантиметра в центре 35-миллиметровой тарелки для культуры тканей. 20 микролитров белка 20 микрограмм на миллилитр, раствор в отмеченной области. С помощью наконечника пипетки распределите белок, раствор которого должен покрыть всю площадь в пределах круга диаметром 0,5 сантиметра.

Важно не прикасаться и не царапать поверхность блюда. Инкубируйте чашки для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Далее промойте каждый белок покрытой глазурью пластину три раза одним миллилитром PBS.

После удаления PBS с третьей промывочной пластины 50 мкл 1%-ной БСА в отмеченную область для блокирования неспецифического связывания на пластине. Выдерживать при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов. Через два часа.

Вымойте заблокированную тарелку три раза одним миллилитром PBS. Приготовьте растворы химерных белков рецептора адгезии ФК для покрытия и используйте этот эксперимент и ICAM один ФК Кира в концентрации 25 мкг на миллилитр и селектин P ФК Кира в концентрации 0,5 мкг на миллилитр. Покройте отмеченный участок 50 микролитрами субстрата, инкубируйте чашки для культуры тканей в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Посуду следует использовать в течение двух дней, при этом нельзя допускать пересыхания покрытого участка. При необходимости. Добавьте PBS для поддержания 50 микролитров раствора на тарелке.

Нейтрофилы для этого исследования выделены из крови участников, давших письменное информированное согласие. После сбора крови методом флеботомии в пробирку для сбора крови с антикоагулянтом или вакутайнер, разбавьте кровь один к одному с помощью PBS, выполните все этапы этой процедуры. При комнатной температуре приготовьте двухслойный фи колл для разделения мононуклеаров периферической крови или р-БМК и нейтрофилов в центрифужных пробирках объемом 50 миллилитров.

Сначала добавьте 15 миллилитров тяжелого сигнала PHI, а затем осторожно нанесите 10 миллилитров легкого вызова поверх тяжелого вызова. Между легкими слоями fi call и тяжелыми fi call должна быть четкая граница. Наконец, осторожно нанесите 25 миллилитров разбавленного образца крови поверх светового сигнала, не нарушая PHI.

Вызывайте слой центрифугирования пробирок в течение 30 минут при комнатной температуре после центрифугирования, должно присутствовать несколько слоев. Слой нейтрофилов с небольшим количеством эритроцитов находится между легким и тяжелым phi. Вызовите с помощью переносной пипетки забор и перенесите слой нейтрофилов в новую 50-миллилитровую пробирку и добавьте PBS до конечного объема 50 миллилитров.

Центрифугируйте при 225 умноженных на G в течение 10 минут. При комнатной температуре после центрифугирования могут оставаться эритроциты, смешанные с нейтрофилами. Отсасывайте надосадочную жидкость до 10 миллилитров.

Марк Ресус. Кратковременно суспензируйте гранулу нейтрофильных эритроцитов, вращаясь на низкой скорости, а затем снова промойте 50 миллилитрами PBS аспирацию надосадочной жидкости, чтобы удалить загрязняющие эритроциты. Ресуспендируйте гранулированные элементы в остаточной PBS с помощью кратковременного низкоскоростного вихря.

Добавьте 25 миллилитров воды и аккуратно перемешайте в течение 10 секунд. К вшам. В красные кровяные тельца добавляют 25 миллилитров 1,8% хлорида натрия и немедленно перемешивают центрифугированием при 225-кратном перегрузке в течение 10 минут.

Теперь загрязняющие эритроциты должны быть отложены, оставив гранулу белых нейтрофильных клеток. Промойте гранулу нейтрофильной клетки PBS, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте выделенные нейтрофилы в среде RPMI с 10% FBS. После определения концентрации клеток под световым микроскопом с помощью гемоцитометра отрегулируйте плотность клеток до 500 000 клеток на миллилитр с полной средой RPMI 10% FBS.

Перед началом анализа адгезии в проточной камере в VE добавляют 20 нанограммов на миллилитр человеческого TNF альфа в течение четырех-шести часов для повышения и стимуляции экспрессии молекул адгезии. Когда ВЭ будут готовы, соберите проточную камеру. Поставьте 35-миллиметровую чашку с сливающейся VE на стол микроскопа.

Для целей этого видео будет исследована только адгезия нейтрофилов к ЖЭ, но та же процедура применима к исследованию адгезии нейтрофилов к очищенным молекулам адгезии. Соедините проточную камеру с параллельной пластиной со шприцевым насосом и вакуумной системой и оставьте одну линию открытой для входа нейтрофилов. Вставьте проточную камеру в верхнюю часть пластины и закрепите узел проточной камеры. Запустите программу видеозаписи на компьютере, подключенном к микроскопу.

Отрегулируйте поле и фокус микроскопа до тех пор, пока не станет видно чистое поле с полностью выросшей VE. С помощью шприцевого насоса промыть проточную камеру средой RPMI. Убедитесь, что в камере или линии ввода нейтрофилов нет пузырьков воздуха.

Используйте шприцевой насос для введения нейтрофилов в проточную камеру с определенной скоростью. Запишите видео, поскольку адгезия нейтрофилов может происходить быстро, четырех-пятиминутного видео обычно достаточно для количественной оценки событий адгезии для анализа. В этом видеоклипе показан пример связывания нейтрофилов с проточной камерой с покрытием HU E.

Адгезивная клетка определяется как клетка, которая перемещается менее чем на один диаметр клетки в течение пяти секунд. На поверхности с покрытием HU e. Здесь показаны скриншоты в разные моменты времени из образцов видео нейтрофилов, прилипших к поверхности ICAM с покрытием one P селектина или поверхности с uve покрытием.

В обоих экспериментах скорость потока нейтрофилов составляет 350 микролитров в минуту при плотности нейтрофилов 500 000 клеток на миллилитр. В типичных условиях было замечено, что от 50 до 70 нейтрофилов человека прочно прилипли к поверхности лиганда или покрытой VE в течение четырехминутного периода записи. Тем не менее, аллельные варианты молекул адгезии нейтрофилов или аллельные варианты в субстрате могут существенно изменить количественную адгезию нейтрофилов путем записи видео одинаковой длины с разными донорами.

Нейтрофилы, количество адгезионных клеток в минуту могут быть рассчитаны для сравнения свойств адгезии между различными донорами. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о визуальной проверке нейтрофилов на предмет зажима клеток, вызванного активацией клеток, вызванной изоляцией. Кроме того, может быть выполнена параллельная проточная цитометрическая оценка активации клеток, чтобы убедиться, что состояние активации клеток совпадает между донорами и между экспериментами.

Этот метод проложил путь исследователям в области аутоиммунитета к изучению клеточной адгезии в первичных клетках человека от доноров генотипа, которые имеют различные кодирующие области аллелей CD 11 B цепи бета-2 интегрина, MAC одного. Эти исследования позволили провести тщательную и количественную оценку функционального воздействия этих аллельных вариантов на организм человека.