Мониторинг Активация противовирусной Распознавание Рецепторы RIG-I И PKR По ограниченной протеазы Пищеварение и Native СТРАНИЦЕ

Врожденная защита от вирусных инфекций запускается рецепторами распознавания образов или РРСС. Присутствует в клетках врожденной иммунной системы во время инфекции. Цитоплазматический глаз установки РРСС и PKR связываются с вирусными сигнатурными РНК подтверждения всех глаз и активируют противовирусную сигнализацию для мониторинга изменений подтверждения глаза и PKR и всей связки in vitro клетки человека A 5 49 инфицированы вирусом лихорадки Рифт-Валли.

Клон 13 для стимуляции активации PRR. Затем подготавливаются клеточные лизаты контрольных и инфицированных клеток для анализа на наличие изменений в глазу и PKR. Проводится ограниченное переваривание триина.

Если произошли подтверждающие изменения в структуре белка, белок более устойчив к перевариванию и полосы будут видны с помощью вестерн-блоттинга. Если все связки произошли выше, видны все риговые глазные и PKR комплексы. Основное преимущество ограниченного расщепления протеазы и нативной страницы заключается в том, что эти методы облегчают прямое измерение активации rega и PKR.

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области врожденного иммунитета, например, какова точная природа и происхождение видов РНК, имеющих отношение к активации ригового глаза и PKR. Эти методы могут дать представление об агонистах ригового глаза и PKR. Они также могут быть применены к другим цитоплазматическим сенсорным белкам, таким как MDA 5, демонстрируя процедуру Мила Вива, аспирант из моей лаборатории перед началом этой процедуры.

Обратите внимание, что клон вируса лихорадки Рифт-Валли 13, далее именуемый CL 13, является аттенуированным мутантом вируса, который в Германии должен обрабатываться в соответствии с двумя условиями BSL для предварительного нагрева бессывороточной среды PBS и среды для культивирования клеток, содержащей 5% FCS. Поместите их на водяную баню в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Приготовьте 1,25 ум на 10 до седьмого БОЕ на миллилитр КЛ 13 в свободной сыворотке среды для инфицирования в 2,5 раза по 10 до шестого.

5 49 клеток с кратностью инфекции или MOI 5 готовят примерно на 10% больше, чем необходимо для учета ошибок пипетирования. Извлеките клетки А 5 49 из инкубатора, аспирируйте среду и добавьте 10 миллилитров PBS для завихрения или наклоните колбу с культурой, чтобы промыть клетки, а затем удалите PBS. Затем добавьте один миллилитр разбавленного CL 13 или для неинфицированной контрольной или имитации инфекции.

Добавьте один миллилитр сыворотки свободной среды и инкубируйте в течение одного часа каждые 15 минут. Осторожно наклоните колбу, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Через час после заражения извлеките инокуляр.

Добавьте пять миллилитров предварительно подогретой среды для клеточных культур с 5% FCS и инкубируйте в течение пяти часов. Приготовьте PBS с 0,5% триттона X 100 и поместите его при температуре четыре градуса Цельсия. Не стоит добавлять сирийские ингибиторы протеазы.

Далее промойте клетки холодным ПБС и добавьте 10 миллилитров свежего ПБС. Затем с помощью скребка для ячеек отделите ячейки от чашки. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 800-кратном перегрузке в течение пяти минут при комнатной температуре.

После отжима удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 30 микролитрах PBS с 0,5% Triton X 100. Переложите лизат в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра и выдерживайте не менее 10 минут на льду. Центрифугируйте лизат при 10 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования переложите лизат осветленных клеток в свежую пробирку. Проведите анализ по методу Брэдфорда для определения концентрации белка в лизате осветленных клеток при температуре минус 20 градусов Цельсия или немедленно приступайте к анализу на предмет подтверждения изменений рецепторов распознавания образов, сначала разведите L один тостохлор, метилкетон обработанный или TPCK трипсин в PBS до конечной рабочей концентрации два микрограмма на миллилитр в двух новых пробирках для каждого состояния, Отрегулируйте конечную концентрацию белка CL 13 и лизатов неинфицированного контрольного белка до 25 мкг в конечном объеме девять микролитров с помощью PBS, один набор лизатов будет использован в качестве входного контроля, а другой будет обработан трипсином TPCK в необработанных контрольных пробирках. Добавьте один микролитр PBS в оставшиеся две пробирки.

Добавьте один микролитр двух микрограммов на микролитр трипсина TPCK, чтобы довести конечную концентрацию до 0,2 микрограмма на микролитр. Перемешайте реакции с помощью пипетирования. Инкубируйте лизаты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 25 минут.

Остановите реакцию, добавив пять x денатурирующего буфера для образца, а затем кипятите в течение пяти минут при температуре 95 градусов Цельсия. Важно не продлевать время инкубации трипсина. Обратите внимание, что точное время расщепления трипсина имеет решающее значение для обнаружения резистентных фрагментов без какого-либо фона, если резистентные белки не обнаружены или если обнаружено слишком большое их количество, скорректированная продолжительность расщепления. Соответственно.

После закипания храните образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия или загрузите образцы на два докаль-сульфата натрия. Полиакриламидные гели, состоящие из 5% стекирующего геля и геля с 12%-ной разрешающей способностью. Разделяйте белки по 25 миллиампер на гель, пока не закончится бромфенольный синий.

После запуска гелей перенесите белки из одного геля на мембрану из фторида полилозы и анализируйте с помощью вестерн-блоттинга антителами, направленными против глаза, и окрашивайте другой гель с помощью kumasi brilliant blue G two 50. Затем храните гель с содержанием 25% этанола, 8% уксусной кислоты и 4% глицерина при температуре четыре градуса Цельсия или приступайте к визуализации и анализу. Для анализа олигомерных состояний рецепторов распознавания образов готовят 50 мкг клеточного лизата в конечном объеме 10 мкм с PBS и добавляют пять х буфера для образца до конечной концентрации один х.

Немедленно загрузите образцы на нативный полиакриламидный гель с 5% укладкой и 8% разрешающим гелем. Любое промедление приведет к потере родных комплексов. Запустите гель со скоростью 20 миллиампер на гель при четырех градусах Цельсия.

Остановите электрофорез через 45 минут после того, как синяя полоса фенола Бромо покинула гель в общей сложности через 1,5-2 часа после выполнения вестерн-блоттинга с использованием антител, направленных против глаза буровой установки, и PKR, как описано в сопроводительном документе, для анализа на подтверждающее переключение и олигоиндуцированное распознаванием вирусного агониста глазом или PKR ограниченное переваривание протеазы и нативная страница были выполнены, как описано в этом видео. Расщепление трипсином фиктивных инфицированных клеточных лизатов привело к быстрой деградации глаза буровой установки, в то время как заражение клоном 13 привело к образованию резистентного фрагмента глаза оснастки длиной 30 килодальтон. PKR также проявляет частичную устойчивость к расщеплению трипсина в инфицированных образцах, что совпадает с его фосфорилированием для контроля эффективности и специфичности расщепления трипсина. Необработанные образцы демонстрируют равное количество загруженных белков, подвергая перевариванию трипсинов псевдо и лизатов клеток C 13 трипсину, что приводит к сопоставимому снижению глобального количества белка.

Это демонстрирует, что лечение трипсином имеет одинаковую эффективность для образцов, инфицированных фиктивным и CL 13 в неинфицированных клетках. В качестве дополнительного контроля были обнаружены только мономеры R EYE и PKR. Был включен фактор транскрипции IRF 3, который присутствует в виде мономера, но, как известно, димеризуется при активации через R Eye.

Инфекция клона 13 приводит к сильному накоплению олигомерных комплексов глаза в виде мазка и трех димеров или олигомеров PKR и IRF в виде определенной белковой полосы. Эти результаты демонстрируют, что ограниченные отклонения в пищеварении и нативной странице являются полезными инструментами для мониторинга подтверждающих изменений и олигообразования глаза оснастки и PKR при заражении. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как контролировать переключение и адаптацию WIC глаз и подтверждения PKR после освоения.

Эту методику можно сделать через два дня после этой процедуры. В качестве такого метода, как про, могут быть проведены анализы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, существует ли стабильное взаимодействие со стимулирующим лигандом после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области врожденного иммунитета к изучению статуса активации рецепторов распознавания образов в вирусно стимулированных клетках.