Мониторинг Активация противовирусной Распознавание Рецепторы RIG-I И PKR По ограниченной протеазы Пищеварение и Native СТРАНИЦЕ

Врожденные защитные механизмы против вирусных инфекций запускаются рецепторами распознавания паттернов (PRR), которые присутствуют в клетках врожденной иммунной системы во время инфекции. Цитоплазматические PRR RIG-I и PKR связывают вирусные сигнатурные РНК, что приводит к изменению их конформации, аллигации и активации противовирусного сигналинга. Чтобы изучить конформационные изменения и аллигацию RIG-I и PKR in vitro, клетки человека линии A549 инфицируют вирусом лихорадки Рифт-Валли.

Клон 13 для стимуляции активации PRR. Затем готовят клеточные лизаты контрольных и инфицированных клеток для анализа конформационных изменений RIG-I и PKR. Проводится ограниченный трипсиновый протеолиз.

Если в структуре белка произошли конформационные изменения, он становится более устойчивым к расщеплению, и при проведении вестерн-блоттинга будут видны соответствующие полосы. Для анализа образования олигомеров проводят электрофорез в нативном PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Если произошло олигомеризование, наблюдаются олигомеры RIG-I и комплексы RIG-I/PKR. Основным преимуществом ограниченного протеолиза и нативного PAGE является то, что эти методы позволяют напрямую измерить активацию RIG-I и PKR.

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области врожденного иммунитета, например, какова точная природа и происхождение видов РНК, которые имеют значение для активации RIG-I и PKR. Данные методы позволяют получить представление об агонистах RIG-I и PKR. Они также могут быть применены к другим цитоплазматическим сенсорным белкам, таким как MDA5; процедуру демонстрирует Мила Вива, аспирантка моей лаборатории, перед началом выполнения данного протокола.

Обратите внимание, что клон 13 вируса лихорадки Рифт-Валли, далее именуемый CL 13, представляет собой аттенуированный мутант вируса, работа с которым в Германии должна проводиться в условиях BSL-2. Предварительно прогрейте бессывороточную среду PBS и среду для культивирования клеток, содержащую 5% FCS. Поместите их в водяную баню в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Приготовьте суспензию CL 13 в бессывороточной среде с концентрацией 1,25 × 10⁷ PFU/мл для инфицирования 2,5 × 10⁶.

Заразите клетки A 5 49 с множественностью инфекции (MOI), равной пяти; подготовьте примерно на 10% больше клеток, чем необходимо, чтобы компенсировать погрешности при пипетировании. Извлеките клетки A 5 49 из инкубатора, аспирируйте среду и добавьте 10 milliliters PBS; аккуратно перемешайте или наклоните культуральный флакон для промывки клеток, затем удалите PBS. Далее добавьте один milliliter разведенного CL 13 или, в случае неинфицированного контроля, используйте имитацию инфекции (mock infection).

Добавьте 1 mL безсывороточной среды и инкубируйте в течение одного часа, перемешивая каждые 15 минут. Осторожно наклоните колбу, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Через один час после инфицирования удалите инокулят.

Добавьте пять миллилитров предварительно подогретой среды для культивирования клеток с 5% FCS и инкубируйте в течение пяти часов. Приготовьте PBS с 0.5% tritton X 100 и выдержите при температуре четыре градуса Цельсия. Ингибиторы сирийской протеазы не добавляйте.

Затем промойте клетки холодным PBS и добавьте 10 milliliters свежего PBS. После этого, используя скребок для клеток, отделите клетки от чашки. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 milliliter и центрифугируйте при 800 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре.

После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в 30 µL PBS с 0,5% Triton X 100. Перенесите лизат в новую пробирку объемом 1,5 mL и инкубируйте не менее 10 минут на льду. Центрифугируйте лизат при 10 000 ×g в течение 10 минут при 4 °C.

После центрифугирования перенесите осветленный клеточный лизат в новую пробирку. Выполните анализ по Брэдфорду для определения концентрации белка в осветленном клеточном лизате. Храните при -20 °C или немедленно переходите к trypsin-дигестии или нативному PAGE для анализа конформационных изменений рецепторов распознавания паттернов. Сначала разведите TPCK-трипсин (обработанный хлорметилкетоном) в PBS до конечной рабочей концентрации 2 µg/mL в двух новых пробирках для каждого условия. Доведите конечную концентрацию белка в лизатах CL 13 и неинфицированном контрольном белковом лизате до 25 µg в конечном объеме 9 µL с помощью PBS. Один набор лизатов будет использоваться в качестве входного контроля (input control), а другой будет обработан TPCK-трипсином. В пробирки с необработанным контролем добавьте 1 µL PBS.

Добавьте один µL TPCK-трипсина в концентрации 2 µg/µL, чтобы конечная концентрация составила 0,2 µg/µL. Перемешайте содержимое пробирок путем пипетирования. Инкубируйте лизаты при 37 °C в течение 25 минут.

Остановите реакцию, добавив пятикратный объем денатурирующего буфера для образцов, а затем прокипятите в течение пяти минут при 95 °C. Важно не превышать время инкубации с трипсином. Обратите внимание, что точное соблюдение времени переваривания трипсином имеет решающее значение для обнаружения резистентных фрагментов без фонового сигнала; если резистентные белки не обнаруживаются или их обнаруживается слишком много, соответствующим образом скорректируйте продолжительность переваривания.

После кипячения храните образцы при температуре -20 °C или нанесите их на два полиакриламидных геля с додецилсульфатом натрия, состоящих из 5% концентрирующего геля и 12% разделяющего геля. Проводите разделение белков при силе тока 25 мА на гель до тех пор, пока бромфеноловый синий не выйдет из геля.

После электрофореза перенесите белки с одного геля на поливинилифторную мембрану и проанализируйте их методом вестерн-блоттинга с использованием антител к RIG-I и PKR; второй гель окрасьте кумасси бриллиантовым синим G-250. Затем храните гель в растворе, содержащем 25% ethanol, 8% acetic acid и 4% glycerol, при температуре 4 °C или приступайте к визуализации и анализу. Для анализа олигомерных состояний рецепторов распознавания паттернов подготовьте 50 µg клеточного лизата в конечном объеме 10 µL в PBS и добавьте 5х буфер для образцов до конечной концентрации 1х.

Немедленно нанесите образцы на нативный полиакриламидный гель с 5% концентрирующим и 8% разделяющим гелем. Любая задержка приведет к потере нативных комплексов. Проводите электрофорез при силе тока 20 мА на гель при температуре 4 °C.

Остановите электрофорез через 45 минут после того, как полоса бромфенолового синего выйдет из геля, что в общей сложности займет примерно от 1,5 до двух часов. Затем выполните вестерн-блоттинг с использованием антител к RIG-I и PKR, как описано в сопроводительном документе, для анализа конформационного переключения и олиго-индуцированного распознавания вирусного агониста белками RIG-I или PKR. Ограниченный протеолиз и нативный ПААГ-электрофорез проводили в соответствии с описанием в данном видео; переваривание трипсином лизатов неинфицированных клеток привело к быстрой деградации RIG-I, тогда как при инфицировании клоном 13 образовался устойчивый фрагмент RIG-I массой 30 kDa. PKR также проявляет частичную устойчивость к перевариванию трипсином в инфицированных образцах, что совпадает с его фосфорилированием. Для контроля эффективности и специфичности переваривания трипсином гели окрашивали кумасси бриллиантовым синим G-250. Необработанные образцы демонстрируют равное количество внесенных белков; воздействие трипсина на лизаты неинфицированных клеток и клеток, инфицированных C13, приводит к сопоставимому снижению общего количества белков.

Это демонстрирует, что обработка трипсином обладает одинаковой эффективностью для контрольных образцов и образцов, инфицированных CL 13, в неинфицированных клетках. В качестве дополнительного контроля были обнаружены только мономеры R EYE и PKR. Также был включен транскрипционный фактор IRF three, который присутствует в форме мономера, но, как известно, димеризуется при активации через R Eye.

Инфицирование клоном 13 приводит к выраженному накоплению олигомерных комплексов RIG-I в виде шлейфа, а также димеров или олигомеров PKR и IRF3 в виде четких белковых полос. Эти результаты демонстрируют, что ограниченный трипсин-протеолиз и нативный электрофорез в ПААГ являются полезными инструментами для мониторинга конформационных изменений и олигомеризации RIG-I и PKR при инфекции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как отслеживать переключение конформации и олигомеризацию RIG-I и PKR, как только вы освоите данную методику.

Данную методику можно выполнить за два дня, следуя данной процедуре. Кроме того, могут быть проведены такие методы, как анализы на определение белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о наличии стабильного взаимодействия со стимулирующим лигандом после его разработки. Этот метод открыл исследователям в области врожденного иммунитета путь к изучению статуса активации рецепторов распознавания паттернов в клетках, стимулированных вирусом.