Роман Растяжка Платформа для приложений в клеточной и тканевой Mechanobiology

Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать новизну изотропной растягивающей платформы, которая может быть использована для исследования реакции отдельных клеток на сложную механическую деформацию и для количественной оценки механических свойств биологических тканей. Это достигается путем предварительного изготовления гибкой мембраны и установки этой мембраны на набор зажимов. Второй шаг заключается в культивировании двух клеток С 12 на мембране в течение ночи, а на следующий день монтаже зажимов на растягивающей платформе.

Затем, во второй серии экспериментов, ткани грудного отдела аорты отторгаются от мышиной модели и очищаются от любых соединительных тканей. Затем ткань аорты монтируется на платформу для растяжения с помощью другого набора зажимов. В конечном счете, платформа растяжения используется для индуцирования деформации клеток в двух ортогональных направлениях, которые могут быть количественно определены с помощью инвертированного микроскопа.

В качестве альтернативы в устройство для растяжения встроен преобразователь силы для измерения жесткости тканей. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как одноактуальное или двухосное растяжение клеток, заключается в том, что он позволяет независимо контролировать деформацию в двух ортогональных направлениях в прозрачной мембране, к которой прикреплены клетки, и, следовательно, позволяет визуализировать живые клетки. Микроскопия также тщательно конструирует различные наборы зажимов.

Благодаря интеграции четырехструнного пользователя на платформу, мы можем провести 10 испытаний клеток на биологических тканях для количественной оценки их механических свойств. В этом видео представлена платформа Biaxial Stretching, специально разработанная установка, которую можно использовать для исследования влияния деформации подложки на клеточном уровне и проведения испытаний на растяжение биологических тканей. Конструкция и особенности двухосной растягивающей платформы подробно описаны в сопроводительной рукописи для исследования влияния механической деформации отдельных клеток, сначала необходимо изготовить гибкую и прозрачную подложку, на которую могут прилипать клетки.

Чтобы начать эту процедуру, пипетку 500 микролитров раствора флуоресцентной микросферы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугировать при давлении 16 200 G. В течение 10 минут выбросьте супернат и добавьте 500 микролитров изопропанола с последующим пятиминутным вортексированием. Отложите флакон на ночь в темноте, чтобы на следующее утро крупные агрегаты частиц могли осадиться, осторожно переложите SNAT в чистую пробирку для микроцентрифуги. Этот раствор может быть использован для изготовления более пяти подложек, поскольку раствор гранул будет продолжать осаждаться в течение следующих трех дней.

Важно избегать суспензии Resus на пеллете. Налейте 0,5 грамма отвердителя, входящего в комплект PDMS, во флакон микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 15 микролитров флуоресцентных шариков и вортекс на одну минуту.

Повторите это еще пять раз, чтобы добавить в общей сложности 90 микролитров бусин. Взвесьте 10 грамм PDMS, добавьте 0,5 грамма отвердителя, дополненного флуоресцентными шариками, и перемешивайте не менее 12 минут. Затем с помощью переводной пипетки перенесите четыре миллиграмма PDMS с шариками в крестообразную форму SUH 2050, предварительно изготовленную с использованием стандартных методов фотолитографии.

Форма имеет высоту 320 микрометров и площадь 13,4 квадратных сантиметра и может содержать 428 микролитров или 440 миллиграммов PDMS для отверждения PDMS в течение двух часов при 80 градусах Цельсия. После отверждения кожуры от основания от формы, субстрат можно выдерживать в чашке Петри при комнатной температуре в течение двух недель, не проявляя существенных изменений и его механических свойств. Высыпьте капли PDMS в чашку Петри с окончательным размером примерно четыре миллиметра в диаметре, высушите их вверх дном в течение двух часов при температуре 80 градусов Цельсия, чашку необходимо держать вверх дном, чтобы капли не сплющивались в процессе отверждения.

Эти элементы якоря могут храниться в чашке Петри неделями. Воздушно-плазменной обработкой подложки и восемью элементами анкеровки, связыванием элементов на каждом конце подложки на расстоянии четырех миллиметров от квадратного форменного углубления, присутствующего на подложке, для крепления мембраны на зажимах. Оберните каждый конец подложки вокруг паз цилиндрической части хомута и закрепите его на месте двумя установочными винтами сверху.

Прикрутите четыре зажима к держателю зажима. Затем залейте PDMS на границе между подложкой и рифленой частью зажимов. Распределите неотвержденный PDMS вокруг рифленой цилиндрической части с помощью шестигранного ключа диаметром 1,5 мм.

Залейте PDMS в бороздки до полного заполнения капиллярным действием и отверждите сборку при 80 градусах Цельсия в течение двух часов до засеивания ячеек на мембрану. Воздушная плазма. Обработайте всю сборку для стерилизации и функционализации подложки, чтобы обеспечить коллагеновое покрытие.

Функционализируйте область субстрата, где клетки будут засеяны, одним миллилитром 0,02 молярной уксусной кислоты с добавлением 16 микрограммов коллагена крысиного хвоста на миллилитр при комнатной температуре в течение одного часа. Желаемая конечная плотность коллагена составляет пять микрограммов на квадратный сантиметр Через час трижды промойте субстрат фосфатным буфером и дайте ему высохнуть при комнатной температуре не менее 10 минут. Добавьте 40 микролитров питательной среды, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллином.

Стрептомицин, содержащий 2000 клеток в центральной части субстрата, покрывает площадь в один квадратный сантиметр. В данном примере плотность ячеек составляет 20 клеток на квадратный сантиметр. Тем не менее, плотность клеток может быть изменена в соответствии с экспериментальными требованиями.

Поместите всю сборку в стандартный инкубатор для клеточных культур субстратом вверх с каплей питательной среды, содержащей на ней клетки. Сборку необходимо держать субстратом вверх не менее трех часов, чтобы клетки могли прочно прикрепиться к ней для предотвращения испарения. В каплю на субстрат добавляется 30 микролитров теплой питательной среды.

Каждые 45 минут через три часа переворачивайте всю сборку в чашку Петри, наполненную свежей питательной средой, чтобы погрузить субстрат в инкубацию на ночь, чтобы позволить клеткам размножаться на следующий день. Установите установку на инвертированный фазово-контрастный или флуоресцентный микроскоп. Установите зажимную подложку в сборе на двухосную натяжную платформу, и двигатели заполнят чашку Петри внутри нагревателя чашки Петри свежеприготовленным буферным раствором соли HEP.

Это физиологическое решение используется для поддержания клеток на предметном столике микроскопа путем имитации нормальной тканевой среды крови. Та же платформа биаксиального растяжения также может быть использована для количественной оценки жесткости небольших образцов тканей. В этой демонстрации будут использоваться изолированные аорты мыши.

Удалите диафрагму, грудную клетку и доли легких у усыпленной мыши, чтобы свести к минимуму риск повреждения тканей. Держите сердце прикрепленным к аорте и избегайте прикосновения к сосуду напрямую, но с помощью манипуляций. С помощью сердца.

Удалите сердце, корень аорты и грудную аорту, аккуратно разрезав между сосудом и позвоночником, чтобы сохранить внутреннюю структуру ткани в целости. Будьте осторожны, чтобы не вызвать удлинение сосуда во время разреза. Немедленно погрузите и держите сердце и аорту в растворе Кребса, который готовится ежедневно и поддерживается при температуре 37 градусов Цельсия во время экспериментов.

Разрежьте и тщательно промойте аорту в растворе Кребса, чтобы удалить сгустки крови, работая под хирургическим препарирующим микроскопом. Удалите соединительную ткань с помощью микроножниц и пинцета. Важно сохранить всю длину сосуда и использовать корень аорты для определения ориентации сосуда.

Размеры незагруженного судна необходимы для определения жесткости судна. Разрежьте аортальное кольцо длиной около двух миллиметров и точно измерьте его длину с помощью калиброванного микроскопа. Отложите этот сегмент в сторону в решении Креба.

Далее вырезаем два небольших аортальных кольца из участков аорты, оставшихся после удаления двухмиллиметрового сегмента. Одно кольцо от участка аорты перед двухмиллиметровым сегментом, а еще одно кольцо от участка аорты. После двухмиллиметрового отрезка поместите оба кольца аорты на предметное стекло микроскопа просветом вверх и измерьте толщину стенки с помощью калиброванной настройки микроскопа.

Толщина стенки аорты измеряется и усредняется с помощью этих двух колец. Заполните чашку Петри на двухосной натяжной платформе раствором Кребса и вставьте двухмиллиметровый сегмент кольца аорты на тянущие штифты. В этом протоколе платформа биаксиального растяжения была использована для исследования механической реакции ядра в одиночных клетках миобласта мыши, подвергшихся деформации субстрата со смещением 25%.

В этих репрезентативных результатах показаны взаимосвязи при выполнении стандартного и чистого одноосевого растяжения. Флуоресцентные бусины подбираются вручную на первом кадре видео и отслеживаются от одного кадра к другому до тех пор, пока не будет достигнута максимальная растяжка по горизонтальному и вертикальному направлениям. Скрипт MATLAB автоматически вычисляет компоненты зеленого тензора деформации для каждого кадра и создает калибровочную кривую деформации по отношению к смещению двигателя.

На этих графиках синяя и красная линии соответствуют компоненте зеленого напряженного движения по горизонтали и вертикали соответственно. Эти результаты иллюстрируют возможности двухосной растягивающей платформы для индуцирования деформации подложки в двух ортогональных направлениях. В дополнение к стандартным одноосевым двухосным полям деформации EQU, двухосная растягивающая платформа может индуцировать сложные поля деформации в подложке.

На панели G показано, что растяжение одной и той же подложки на четыре миллиметра по оси x и небольшое растяжение вдоль оси Y на 1,5 миллиметра, выделенных красным цветом, дает чистое одноосевое поле без деформации сжатия в подложке. На панели, H показано, что растяжение подложки вдоль оси x на 3,5 миллиметра приводит к деформации на 25% и деформации при сжатии 7% при фиксации концов подложки вдоль вертикальной оси, выделенных красным цветом С возможностью проведения микроскопии живых клеток во время растяжения ядра окрашивались флуоресцентным красителем живых клеток, который связывает ДНК, а затем растягивались на 25% вдоль каждой оси ортогонального растяжения как Как показано на рисунке, между каждой фазой цикла растяжения были получены контрастные изображения и эпифлуоресцентные изображения несформированного и деформированного ядра. Длины большой и малой оси ядра вдоль несформированного состояния и при последовательном растяжении ядра вдоль его большой и малой оси были определены с помощью плагина image J и использованы для вычисления относительного изменения длины.

Вдоль каждой оси на этой линейчатой диаграмме X или большая ось показана синим цветом, а y или малая ось — красным. Деформирующая способность ядра проявляет механическую анизотропию, поскольку оно проявляет значительно более высокую способность к деформации вдоль его малой оси, по сравнению с его большой осью, роль цитоскелета актина и микротрубочек в регулировании способности к ядерной деформации была изучена путем деполимеризации, селективно используя деполимеризацию цитофилей или микротрубочек с использованием соответственно цито-D и неола. Было обнаружено, что актиновые филаменты или микротрубочки индуцируют потерю анизотропной деформуемости ядра.

Эти результаты подтверждают выводы о том, что компоненты цитоскелета передают силы к ядру от субстрата, а также необходимы для сохранения естественного механического поведения ядра. Во время деформации биаксиальная платформа растяжения также использовалась для оценки влияния хронической сверхэкспрессии белка теплового шока 27 или HP 27 на жесткость сосудов HSP над экспрессией. В мышиной модели, склонной к атеросклерозу, гомозиготный негатив A POE модифицирует гистологический состав поражений атеросклероза за счет увеличения гладкомышечных клеток интимы и содержания коллагена.

Чтобы определить влияние этого гистологического ремоделирования на механические свойства сосуда, для измерения жесткости аорты была использована платформа для растяжения. На этом графике показана типичная кривая деформации напряжения, полученная при растяжении аортального сосуда, при этом жесткость рассчитывается как 30% деформации. Жесткость — это наклон касательной, обозначенной красной линией к кривой.

Установлено, что жесткость аортальных сегментов HSP 27 по сравнению с экспрессирующими мышами была достоверно увеличена на 41% по сравнению с моделью контрольной мыши. В совокупности механическая оценка в сочетании с гистологией сосудов и бляшек показала, что гиперэкспрессия HSP 27 характеризуется повышенной жесткостью сосудов и содержанием гладкомышечных клеток коллагена. Эти результаты свидетельствуют о том, что HSP 27 потенциально может повысить стабильность атеросклеротических поражений и, следовательно, снизить риск разрыва бляшки после ее развития.

Этот метод открывает новый способ для исследователей в области биоинженерии изучать реакцию клеток на сложные и инотропные механические деформации для применения в механической биологии, а также для мониторинга механики биологических тканей при заболеваниях.