Недорогой метод для анализа захват как активность и движение в Дрозофилы

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении изменений в локомоторном или судорожном поведении у дрозофил. Это достигается путем разделения мух на отдельные флаконы с использованием анестезии. Далее используется простая веб-камера для записи движения мух.

Затем данные импортируются на изображение J для начала анализа. Наконец, для определения расстояния, скорости и продолжительности движения в течение периода регистрации используется специально разработанное программное обеспечение для анализа мух. В конечном счете, этот анализ может показать изменения в опорно-двигательном или судорожном поведении, которые связаны с генетическими и фармакологическими манипуляциями.

Этот недорогой метод записи, который мы собираемся описать, может быть использован как для анализа судорожного поведения, так и для передвижения у плодовых мушек. В частности, мы использовали его для идентификации генетических и фармакологических манипуляций, которые изменяют судорожное поведение у этих мух. Но сегодня Крис Бёрнер, научный сотрудник моей лаборатории, продемонстрирует эту технику: для начала настроят веб-камеру, которая будет записывать мух во время локомоторных и судорожных анализов.

Как только камера будет на месте, откройте удобную программу A VI. Чтобы настроить параметры записи, выберите параметр цейтраферной съемки на вкладке захвата, а когда откроется новое окно, выберите веб-камеру в качестве устройства захвата. Для большинства экспериментов достаточно размера видеокадра шесть 40 на четыре 80 В параметре сжатия выберите кодек Intel IUV и установите секунды на кадр в соответствии с анализом.

На вкладке «Дополнительно» создайте файл растрового изображения для каждого снимка и выберите папку, в которой программа будет хранить стек изображений после записи. Далее поместите мертвую муху на лист бумаги. Нажмите на окно настроек видео и на вкладке настроек устройства отрегулируйте параметры до тех пор, пока яркий белый фон не будет четко контрастировать с более темной мухой.

Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать запись. По окончании периода записи нажмите кнопку «Стоп». Теперь стек изображений должен находиться в папке, выбранной для начала анализа опорно-двигательного аппарата.

Переложите мух в отдельные флаконы, закрытые ватной пробкой. Дайте мухам спокойно посидеть в течение 20-30 минут, прежде чем продолжить. По истечении этого времени аккуратно постучите тестируемую муху из флакона и под крышкой чашки Петри.

Крышка должна содержать небольшие прорези, чтобы обеспечить расположение воздушного потока мухи под ранее настроенной веб-камерой. Когда все будет готово, нажмите кнопку «Старт», чтобы начать запись опорно-двигательного аппарата. Первым этапом анализа судорог является кормление двухдневных мух, чувствительных к судорогам, либо стандартными средами, либо средами, смешанными с исследуемым препаратом.

После двух дней кормления пересадите мух, осторожно постукивая по отдельным пустым флаконам, и закройте флаконы ватной пробкой. Дайте мухам спокойно посидеть в течение 20 минут перед наблюдением. Когда все будет готово, наведите флакон на лабораторный вихрь или на максимальные настройки в течение 10 секунд.

Сразу же поместите обездвиженную муху на белый лист бумаги прямо под веб-камерой. Как только вы будете на месте, начните запись. Это приводит к активности мух.

Муха будет претерпевать быстрые нескоординированные движения, перемежающиеся периодами паралича. Запись заканчивается, как только муха выпрямляется. Чтобы начать анализ данных, откройте бесплатное программное обеспечение для обработки изображений image J после открытия.

Импортируйте нужный стек изображений, сначала кликнув по вкладке «Файл», а затем выбрав «Импорт». И, наконец, последовательность изображений. Выберите папку, содержащую стек изображений, и откройте изображение.

Когда откроется диалоговое окно параметров последовательности, выберите сортировку имен по числам, а затем выберите их. Хорошо. Теперь стек изображений будет загружен в Image J. Далее выберите вкладку изображения и установите тип значения на восемь бит. Нажмите на вкладку изображения еще раз и выберите порог в разделе «Настройка».

Это устанавливает порог для всех изображений таким образом, чтобы каждое из них состояло из белого фона, а муха превращалась в черную точку. При этом также открывается диалоговое окно порога, в котором можно настроить точки отсечения. Просмотрите изображения, чтобы увидеть, есть ли на них лишние черные точки или отсутствует пятно.

При необходимости отрегулируйте порог, чтобы облегчить любые проблемы. После внесения корректировок выберите «Применить» в диалоговом окне порогового значения. Когда откроется диалоговое окно преобразования в маску, нажмите OK, чтобы установить пороговое значение стека изображений.

Чтобы измерить движение мухи в пикселях, выберите плагин мультитрекера на вкладке плагинов. Когда появится диалоговое окно отслеживания объектов, нажмите на все четыре предложенных варианта и выберите. Хорошо. Затем плагин мультитрекера прикрепит координаты к черному цвету.

в каждом фрагменте и перечислите их в окне результатов, а также общую длину в пикселях. Окно путей дает графическое отображение пути, по которому прошла муха. Скопируйте список координат X и Y из окна результатов и вставьте данные в таблицу Excel.

Если на каком-либо слайде в стеке нет черного слайда, программа мультитрекера остановится на этом слайде. Если это произойдет, повторно установите порог стека, чтобы убедиться, что муха зарегистрирована как черная.

на рассматриваемом слайде. Чтобы преобразовать длину пути из пикселей в сантиметры, возьмите изображение двух точек, расположенных на известном расстоянии друг от друга, на чистом белом листе бумаги. Определите координаты пикселей XY для двух точек и используйте эту информацию для определения количества пикселей, соответствующего одному сантиметру, для получения более точных результатов.

Удалите шум с изображений, импортировав координаты XY в специально созданную программу анализа мух. После открытия импортируйте данные из каждого генотипа или лечения в отдельные таблицы. Далее выберите вкладку сводного листа и нажмите на кнопку «Нажмите мне».

Выберите пороговое значение в соответствии с типом анализа, нажмите ОК, и программа рассчитает скорость, время и расстояние движения. Эти репрезентативные пути проявляют судорожную активность у мутантных мух с лечением метформином и без него. Судорожная активность была снижена при лечении у двух протестированных мутантов.

Метформин значительно уменьшал как расстояние, пройденное во время анализа судорог, так и общую продолжительность судорожной активности. Напротив, не было никаких изменений в средней скорости в этих отдельных локомоторных траекториях. Траектория полета дикого типа CS показывает концентрацию вокруг периферии круговой арены.

В то время как траектория мухи с мутантным BSS показывает ту же концентрацию, но с меньшим движением в целом. При тестировании на локомоцию в новой среде мутанты BSS продемонстрировали значительное уменьшение длины пути по сравнению с мухами CS. Анализ также обнаружил изменения в скорости движения во время исследования мухи CS во время локомоторного анализа.

Муха BSS оставалась относительно неактивной на протяжении всего испытания, за исключением нескольких всплесков активности. Одна из самых важных вещей, о которой следует помнить при выполнении любого из этих поведенческих анализов с помощью этой техники, — это убедиться, что вы не обезболиваете мух перед проведением записи. Оказывается, что анестезия влияет как на судорожное поведение, так и на поведение опорно-двигательного аппарата и может значительно изменить ваши результаты.