Крио-электронной микроскопии Изготовление образцов с помощью электронного луча, сфокусированного

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке образца для криоПЭМ путем извлечения сфокусированной ионно-лучевой ламели из криогенного замороженного объемного образца. Это достигается путем первого погружения, замораживания образца в жидком азоте и установки его внутри криосфокусированного ионного пучка SEM. Второй шаг заключается в вырезании тонкого LA Melo с помощью ионного пучка и переносе его на сетку TEM с помощью охлаждаемого наноманипулятора.

Далее сетка ПЭМ передается от держателя СЭМ к держателю ПЭМ на передаточной станции. Заключительным этапом является передача держателя ПЭМ в крио ПЭМ для дальнейшего анализа. В конечном счете, криоПЭМ используется для отображения изображений с высоким разрешением, томо Грэхема или рентгеновских карт извлеченной ламели.

Этот метод позволит нам анализировать мягкие вещества с максимальным разрешением в просвечивающем электронном микроскопе, предварительно выбирая место анализа с помощью других микроскопий, таких как световая микроскопия или сканирующая электромикроскопия. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как криомикротомия Mac, заключается в том, что исключаются такие артефакты подготовки, как сжатие и образование def образца. Сначала монтируются две сетки ПЭМ для сфокусированных образцов ионного пучка.

На держателе РЭМ закрепите сетки, закрутив соответствующие винты с отверткой, и закройте жалюзи, установите подходящий для образца корешок и добавьте часть образца. Например, с помощью пипетки можно нанести капли на плоский стержень. Затем установите держатель переноса SEM на вакуумное передаточное устройство или VTD.

После добавления жидкого азота в станцию слякоти и откачки вниз откройте станцию и погрузите в погружение снова заморозьте держатель передачи SEM до тех пор, пока не завершится закипание и снова не будет получена слякоть. Далее втяните держатель переноса SEM в вакуумную камеру VTD и запломбируйте его. Вентиляция станции слюны и камеры подготовки крио Воздушный шлюз Вентиляция внешнего шлюза.

Затем совместите уплотнение VTD с воздушным шлюзом камеры криоподготовки и насоса. Когда будет достигнут хороший уровень вакуума, измерьте штифт воздушного шлюза, чтобы открыть уплотнение VTD и внешний воздушный шлюз. Затем вставьте держатель переводника SEM.

После этого с помощью холодного ножа откройте защитные крышки прорезей сетки ПЭМ. Выключите высокое напряжение на сфокусированном ионном пучке SEM и откройте внутренний воздушный шлюз. Затем с помощью VTD переместите держатель SEM в камеру для образцов.

Как только держатель SEM окажется в холодной стадии, отсоедините VTD, толкая и вращая. Втяните шток VTD до упора в вакуумную камеру VTD и закройте внутренний воздушный шлюз, внешний воздушный шлюз и уплотнение VTD. На этом этапе нагрейте прекурсор до 24-26 градусов Цельсия и расположите систему впрыска газа или иглу КРУЭ на высоте около одного миллиметра над поверхностью образца.

Во время визуализации с помощью электронного луча откройте газовый клапан на несколько секунд. Затем отверждайте отложение в интересующей области, или ROI, используя пучок ионов с силой 1000 пикоампир при малом увеличении. После отверждения наклоните образец на 52 градуса так, чтобы поверхность была перпендикулярна ионному пучку.

Мельница. Две окопы террористов. По обе стороны от ROI наклоните образец обратно на нулевой градус и с помощью ионного луча отрежьте боковые и нижнюю стороны ламели, убедившись, что следы среза проходят через всю ламель.

После того, как игла ГИС будет вставлена, маневрируйте наноманипулятором до тех пор, пока его кончик не войдет в физический контакт с пластинкой, желательно сбоку. Откройте клапан КРУЭ на несколько секунд и контролируйте криоосаждение путем непрерывной визуализации электронным лучом. Когда дополнительный слой платины в один-два микрометра будет подвергнут криоосаждению, закройте клапан, после чего платина отверждается только в нескольких микрометрах вокруг точки, где наноманипулятор контактирует с пластинкой.

Затем используйте ток высокого ионного пучка, чтобы освободить ламель. Осторожно маневрируйте наноманипулятором, чтобы извлечь ламель из траншеи и переместить ее на высоту не менее 500 микрометров над поверхностью образца. После втягивания иглы опустите предметный столик на несколько миллиметров и перемещайте его до тех пор, пока в поле зрения не окажется одна из сеток ПЭМ.

Переместите область крепления на сетке в рабочее положение и вставьте иглу КРУЭ. Затем осторожно маневрируйте наноманипулятором, чтобы привести прикрепленную ламель в физический контакт с областью крепления на сетке ПЭМ, откройте газовый клапан на несколько секунд и нанесите на крио дополнительный слой платины в один-два микрометра, отверждайте платину только в нескольких микрометрах вокруг точки контакта между ламелей и сеткой ПЭМ. Затем с помощью высокого тока ионного пучка отрежьте ламель от наноманипулятора.

Наклоните образец на 52 градуса и с помощью ионного пучка разбавьте его до электронной прозрачности. После промывки криопередаточной станции сухим газообразным азотом вставьте держатель криотрансфера TEM в соответствующий слот криопередаточной станции и заполните жидким азотом. Вслед за этим погружают отвертку, ТЭМ образец зажимного инструмента и пинцет в криогенный стаканчик, наполненный жидким азотом для того, чтобы охладить их кончики до нужной температуры.

После того, как VTD будет согласован с внешним шлюзом, доведите холодную ступень до высоты передачи 16 миллиметров. После выключения высокого напряжения откройте уплотнение VTD, внешний воздушный шлюз и внутренний воздушный шлюз. Затем используйте стержень VTD для фиксации в держателе переводника SEM, надавливая и вращая по часовой стрелке.

На этом этапе втяните держатель переноса SEM в камеру криоподготовки. Холодным ножом закройте защитные крышки сеток ПЭМ. Затем с помощью стержня VTD переместите образец в вакуумную камеру VTD, закройте и загерметизируйте воздушный шлюз.

Затем продуйте внешний воздушный шлюз и отсоедините VTD. Сопоставьте VTD с портом SEM криопередающей станции. Во время промывки сухим азотом используйте штифт на станции, чтобы открыть уплотнение VTD и вставить держатель переноса SEM в исполнитель криопередаточной станции.

С помощью остывшей отвертки откройте одну из крышек и ослабьте соответствующий винт, удерживая сетку ТЭМ на месте. Затем возьмите сетку ПЭМ и поместите ее в держатель ПЭМ с помощью охлаждаемого пинцета. После этого закрепите сетку ПЭМ на держателе ПЭМ.

С помощью охлажденного шестигранного кольца закройте заслонку держателя криотрансфера TEM и отсоедините криопередаточную станцию от насосной системы. Переместите станцию и контроллер нагревателя держателя ПЭМ рядом с ПЭМ и снова подключите их. Установите предметный столик для отбора проб ПЭМ в положение отрицательного 70 градусов.

Далее установите минимальное время откачки шлюза с одним циклом продувки сухим газообразным азотом. Снимите держатель ПЭМ с криопередаточной станции и вставьте его в первую ступень наклонного гониометра, который запустит цикл откачки. После завершения цикла установите угломер так, чтобы он наклонился обратно на ноль градусов, удерживая держатель TEM так, чтобы он не вращался вместе с гониометром.

Затем вставьте держатель через гониометр полностью внутрь ПЭМ. Наконец, наполните держатель криотрансфера TEM жидким азотом. В этом методе споры aspergillus Niger сначала визуализируются с помощью SEM для идентификации места экстракции.

Поперечного сечения любой споры достаточно, но можно расположить ROI для экстракции с субмикрометровой точностью, чтобы разрезать конкретную клетку на определенном расстоянии от клеточной мембраны. После того, как интересующий вас объект идентифицирован, выполняется первый этап криоосаждения: чтобы защитить образец от повреждения пучком во время ионного измельчения, образец наклоняют на 52 градуса, после чего распыляют две траншеи по обе стороны от меллы. Затем образец наклоняют назад и далее фрезеруют, оставляя только два небольших моста, соединяющих его с основной массой.

Охлажденный наноманипулятор вступает в контакт с меллой, и еще одно криоосаждение платины спаивает их вместе. Небольшие соединительные мосты фрезеруются, и наноманипулятор перемещает ламель рядом с областью крепления марки ПЭМ, где она спаивается с помощью окончательного криоосаждения платины. Затем наноманипулятор отделяется от ламели, которая тоньше до прозрачности электронов.

С помощью ионного пучка пластинка переносится в ПЭМ, где можно использовать спектроскопию изображения высокого разрешения, томографию и другие методы. Этот метод будет способствовать пониманию интерфейсов мягкой материи сердца в таких системах, как нейрозонды или костные имплантаты. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовить образцы крио ТМ, которые являются артефактом три и могут быть извлечены из определенной области образца жука с субмикрометровой точностью.