Молекулярная профилирования из инвазивным опухоли микроокружения в 3-мерной модели клеток колоректального рака и Экс естественных Фибробласты

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы охарактеризовать отличительную биологию на границе между злокачественными эпителиальными клетками на фронте инвазивной опухоли и связанными с раком стромальными клетками. Это достигается путем предварительного создания первичных культур фибробластов из имплантатов толстой кишки. Вторым шагом является построение органотипических моделей кокультуры с использованием первичных фибробластов толстой кишки и культивируемых клеток колоректального рака.

Затем органотипические модели закрепляются в формине, разрезаются на предметные стекла, установленные на мембране, и окрашиваются гребневым фиолетовым краем. Последним этапом является лазерная микродиссекция с целью отделения вторгшихся опухолевых клеток от неинвазивных опухолевых клеток и связанных с раком стромальных клеток. В конечном счете, методы молекулярного профилирования могут быть использованы для характеристики биологии инвазионных и неинвазионных опухолевых клеток и стромальных клеток в окружающем опухолевом микроокружении.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, насколько четко отличимы вторгшиеся клетки от неинвазивных клеток в трехмерных органотипических моделях колоректального рака. Для начала получите образцы нормальной ткани слизистой оболочки толстой кишки человека непосредственно из хирургической операционной в лаборатории. Поместите образец в центр 10-сантиметровой чашки для культуры тканей, затем трижды промойте культуру фосфатно-соевым буфером или PBS с добавлением пенициллина, стрептомицина и грибковой зоны.

Не аспирируйте после окончательного промывания стерильными щипцами и скальпелем, разрежьте ткань на мелкие кусочки. Затем поместите каждую деталь в центр креста, нарисованного лезвием скальпеля. В 12-луночной пластине осторожно покачайте скальпелем над тканью, чтобы позволить ей прилипнуть к культуре.

Образцы содержат 750 микролитров первичной питательной среды фибробластов, которая должна погружать ткань, не позволяя ей плавать. Затем поместите образцы в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и содержанием CO2 от 5 до 10% в течение следующих пяти дней. Фибробласты начинают медленно расти от края ткани примерно через семь дней.

Это станет более заметным примерно через три-четыре недели. А если фибробластов вырастает достаточное количество, добавьте по 750 микролитров трипсина в каждую лунку после того, как клетки отделят бассейн, и перенесите их в колбу для культуры тканей Т25 для органотипического геля, пропитанного фибробластами. Во-первых, приготовьте суспензию клеток фибробластов, содержащую 500 000 клеток на гель в дополненном дмм.

Составьте органотипические гели на льду в соотношениях, найденных в текстовом протоколе для девяти гелей по одному миллилитру на гель. Подготовьте 10 миллилитров и аккуратно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков. Затем добавьте по одному миллилитру в каждую лунку планшета 24 лунки и инкубируйте в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере.

Чтобы гели застыли через час, добавьте один миллилитр дополненного DM EM поверх гелей и верните в инкубатор на ночь. На следующий день. Аспирируйте среду из верхней части геля и нанесите один миллилитр среды, содержащей 500 000 эпителиальных клеток колоректального рака, для покрытых гелем нейлоновых листов.

Заранее подготовьте стерильные автоклавы из капроновых листов размером 1,5 сантиметра на 1,5 сантиметра с помощью стерильных щипцов. Поместите необходимое количество капроновых листов в 10-сантиметровую посуду для культуры. Приготовьте гелевую смесь на льду, как описано в текстовом протоколе, и добавьте в гелевую смесь 0,1 молярного гидроксида натрия до тех пор, пока она не станет розовой, что указывает на нейтрализацию раствора.

Затем добавьте по 250 микролитров этого раствора в каждый капроновый лист. Затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с концентрацией 5% CO2 в течение 30 минут, чтобы гель застыл. Далее добавьте 10 миллилитров 1%-ного раствора глутаральдегида в PBS в каждую 10-сантиметровую посуду для культуры.

Как только гель застынет перед инкубацией при четырех градусах Цельсия в течение одного часа, затем промойте нейлоновые листы три раза в PBS и один раз в дополненном dme. Инкубируйте листы в течение ночи в том же буфере при четырех градусах Цельсия, чтобы поднять органотипические гели на стальные решетки для вторжения стерилизованных решеток строительных лесов, которые были подготовлены путем складывания листов из нержавеющей стали в формацию штатива. Затем с помощью щипцов, стерилизованных и этанола, поместите стальную сетку в каждую лунку шестилуночной пластины.

Поместите на каждую сетку нейлоновую пластину с гелевым покрытием коллагеновой стороной вверх. Осторожно перенесите органотипические гели из 24-луночной пластины на рельефный нейлоновый лист с помощью шпателя, стерилизованного и этанола. Заполните лунку дополненным D mem до тех пор, пока нейлоновый лист не будет соприкасаться со средой, но не погружаться в воду.

Следите за тем, чтобы средство не соприкасалось с органотипическим гелем. Инкубировать в течение 14 дней при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с содержанием 5% CO2. Заменяя среду каждые два дня.

Удалите весь органотипический лист, включая капроновый лист, из колодца и поместите его на пищевую пленку. Рассеките органотипный и нейлоновый лист пополам с помощью чистого одноразового скальпеля и зафиксируйте обе половинки в формальдегиде на 24 часа. При комнатной температуре замените формальдегид на 70% этанол через 24 часа и оставьте на ночь перед погружением в парафин, срезом и окрашиванием для выполнения лазерной микродиссекции.

Первая секция, органотипическая толщина до 10 микрон на мембранных предметных стеклах. После обработки участков в соответствии с текстовым протоколом подготовьтесь к проведению лазерной микродиагностики с использованием выбранной формы платформы. Поместите предметное стекло так, чтобы часть пятна была микрорассечена.

На предметный столик для микроскопа лицевой стороной вниз установите микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра в кассету для сбора и добавьте 50 микролитров буфера для лизиса клеток в колпачок, в который будет собираться микрорассеченная ткань под прямым зрением. С помощью джойстика определите интересующую ткань и с помощью программного интерфейса аннотируйте окрашенный органический участок, выделив клетки, подлежащие микродисекции, на фронте инвазии опухоли. Дайте команду лазеру выстрелить, который должен одновременно вырезать выделенный участок и продвинуть микродиссективную ткань в колпачок микроцентрифужной пробирки.

Приступайте к обработке образцов подходящим методом для извлечения интересующего аналита. Здесь представлены изображения лазерной микродиссекции клеток колоректального рака SW 480, инвазирующих в органотипическую строму. Гребневая фиалка используется для выделения эпителиальных клеток колоректального рака.

Затем определяются инвазивные опухолевые островки перед проведением лазерной диссекции, и отрезанный кусок транспортируется к устройству для сбора. Неинвазивные клетки и стромальные клетки идентифицируются и выделяются с использованием одной и той же методологии. Трехмерные кокультуры были проанализированы с помощью профилирования микроРНК для сравнения дифференциально экспрессируемых микроРНК между клетками на фронте инвазивной опухоли и клетками в стратифицированных опухолевых зонах.

Данные были отсортированы по полному изменению и значениям данных плюс-минус в два раза. Представлены изменения по сравнению с репрезентативным экспериментом, показывающие дифференциальную экспрессию генов микроРНК между инвазивными маргинальными клетками и неинвазивными маргинальными клетками. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как строить анатомически подходящие органотипические модели и как использовать лазерную микродиссекцию для выделения отдельных популяций клеток для дальнейшего изучения. Тпру.