Молекулярная профилирования из инвазивным опухоли микроокружения в 3-мерной модели клеток колоректального рака и

Общая цель данной процедуры заключается в характеристике особенностей биологии на границе раздела между злокачественными эпителиальными клетками на инвазивном фронте опухоли и раковыми ассоциированными стромальными клетками. Это достигается путем первоначального создания первичных культур фибробластов из имплантатов толстой кишки. Вторым этапом является создание органотипических моделей совместного культивирования с использованием первичных фибробластов толстой кишки и культивируемых клеток колоректального рака.

Затем органотипические модели фиксируют в формалине, делают срезы на предметных стеклах с нанесенной мембраной и окрашивают кристаллическим фиолетовым. Заключительным этапом является лазерная микродиссекция для отделения инвазивных опухолевых клеток от неинвазивных опухолевых клеток и стромальных клеток, ассоциированных с раком. В конечном итоге могут быть использованы методы молекулярного профилирования для характеристики биологии инвазивных и неинвазивных опухолевых и стромальных клеток в окружающем микроокружении опухоли.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы заметили, насколько четко отличающиеся инвазивные клетки видны на фоне неинвазивных клеток в трехмерных органотипических моделях кокультивирования колоректального рака. Для начала получите образцы нормальной слизистой оболочки толстой кишки человека непосредственно в операционной или в лаборатории. Поместите образец в центр чашки для культивирования тканей диаметром 10 сантиметров, затем трижды промойте культуру фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с добавлением пенициллина, стрептомицина и фунгизона.

Не аспирируйте после финальной промывки; с помощью стерильного пинцета и скальпеля разрежьте ткань на мелкие кусочки. Затем поместите каждый кусочек в центр креста, начерченного лезвием скальпеля. В 12-луночном планшете осторожно покачайте скальпелем над тканью, чтобы она прикрепилась к поверхности культуры.

Поместите образцы в 750 µL первичной среды для роста фибробластов; среда должна полностью покрывать ткань, но не допускать ее всплытия. Затем поместите образцы в инкубатор при 37 °C и 5–10% CO2 на следующие пять дней. Примерно через семь дней фибробласты начнут медленно расти из края ткани.

Это станет более заметным примерно через три-четыре недели. Если выросло достаточное количество фибробластов, добавьте по 750 µL трипсина в каждую лунку; после открепления клеток объедините их и перенесите в культуральный флакон T 25 для получения органотипического геля с введенными фибробластами. Сначала приготовьте суспензию фибробластов, содержащую 500 000 клеток на один гель, в дополненной среде dmm.

Приготовьте органотипические гели на льду в пропорциях, указанных в текстовом протоколе, для девяти гелей по 1 мл на каждый. Приготовьте 10 мл смеси и аккуратно перемешайте, чтобы избежать появления пузырьков. Затем добавьте по одному миллилитру в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C в увлажненной атмосфере.

Чтобы гели застыли, через один час добавьте один миллилитр дополненной среды DMEM поверх гелей и верните их в инкубатор на ночь. На следующий день аспирируйте среду с поверхности гелей и высейте один миллилитр среды, содержащей 500 000 эпителиальных клеток колоректального рака, на нейлоновые листы с гелевым покрытием.

Заранее подготовьте стерильные автоклавированные нейлоновые листы размером 1,5 сантиметров на 1,5 сантиметра, используя стерильный пинцет. Поместите необходимое количество нейлоновых листов в чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Приготовьте гелевую смесь на льду согласно текстовому протоколу и добавляйте 0,1 молярный гидроксид натрия в смесь до тех пор, пока она не окрасится в розовый цвет, что будет указывать на нейтрализацию раствора.

Затем добавьте по 250 µL этого раствора на каждый нейлоновый лист. Инкубируйте при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 30 минут до застывания геля. Далее добавьте по 10 mL 1% раствора глутаральдегида в PBS в каждую чашку для культивирования диаметром 10 cm.

После застывания геля перед инкубацией при четырех градусах Цельсия в течение одного часа промойте нейлоновые листы трижды в PBS и один раз в дополненном dme. Инкубируйте листы в том же буфере в течение ночи при четырех градусах Цельсия, чтобы перенести органотипические гели на стальные сетки — стерилизованные каркасные сетки для инвазии, подготовленные путем складывания листов из нержавеющей стали в форме треноги. Затем с помощью стерилизованных этанолом пинцетов поместите стальную сетку в каждую лунку планшета на шесть лунок.

Поместите на каждую сетку нейлоновый лист с гелевым покрытием коллагеновой стороной вверх. Осторожно перенесите органотипические гели из 24-луночного планшета на приподнятый нейлоновый лист с помощью стерилизованного этанолом шпателя. Заполните лунку модифицированной средой D mem так, чтобы нейлоновый лист контактировал со средой, но не был в нее погружен.

Убедитесь, что среда не соприкасается с органотипическим гелем. Инкубируйте в течение 14 дней при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2, заменяя среду каждые два дня.

Извлеките из лунки весь органотипический срез вместе с нейлоновым листом и поместите его на пищевую пленку. Разделите органотипический срез и нейлоновый лист пополам с помощью чистого одноразового скальпеля и зафиксируйте обе половины в формальдегиде на 24 часа. Через 24 часа при комнатной температуре замените формальдегид 70% ethanol и оставьте на ночь перед заливкой в парафин, срезанием и окрашиванием для проведения лазерной микродиссекции.

Сначала срезы органотипического типа толщиной 10 микрон наносят на предметные стекла с закрепленной мембраной. После обработки срезов согласно текстовому протоколу подготовьтесь к проведению лазерной микродиссекции с использованием выбранной платформы. Поместите предметное стекло с окрашенным срезом, предназначенным для микродиссекции, в прибор.

Установите микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра в коллекционную кассету на предметном столике микроскопа лицевой стороной вниз и добавьте 50 мкл буфера для лизиса клеток в крышку, в которой под прямым визуальным контролем будет собираться микродиссекированная ткань. Используя джойстик, найдите интересующую ткань, а затем с помощью интерфейса программного обеспечения разметьте окрашенный органический срез, выделив клетки на фронте инвазии опухоли, подлежащие микродиссекции. Запустите лазер, который должен вырезать выделенный участок и переместить микродиссекированную ткань в крышку микроцентрифужной пробирки.

Перейдите к обработке образцов подходящим методом для экстракции интересующего аналита. Здесь представлены изображения лазерной микродиссекции клеток колоректального рака линии SW 480, инвазивно прорастающих в органотипическую строму. Кристаллический фиолетовый используется для визуализации эпителиальных клеток колоректального рака.

Затем определяют границы инвазивных опухолевых островков перед проведением лазерной диссекции, после чего вырезанный фрагмент переносится в устройство для сбора. Неинвазивные и стромальные клетки идентифицируют и изолируют тем же методом. Трехмерные кокультуры анализируют с помощью профилирования микроРНК для сравнения дифференциально экспрессируемых микроРНК в клетках на переднем крае инвазии опухоли и в клетках стратифицированных зон опухоли.

Данные были отсортированы по общему изменению и значениям данных с отклонением в два раза в большую или меньшую сторону. Представлены результаты репрезентативного эксперимента, демонстрирующие дифференциальную экспрессию генов микроРНК в клетках инвазивного края и клетках неинвазивного края. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как создавать анатомически соответствующие органотипические модели и как использовать лазерную микродиссекцию для изолирования отдельных популяций клеток для дальнейшего исследования. Ого.