Визуализация эндосоме Dynamics в живых нервных окончаний с Четырехмерное флуоресценции изображений

Общая цель этой процедуры заключается в точном изображении эндосом в трехмерном пространстве во времени или в четырех измерениях. Это достигается путем предварительного рассечения мышц змеи и расстановки тканей в чашке для визуализации. Вторым этапом является окрашивание ткани жизненно важными красителями для стимуляции образования эндосом.

Затем препарат визуализируется в четырех измерениях для одного или нескольких нервно-мышечных соединений. Последним шагом является тщательный анализ данных для характеристики поведения макроэндосом. В конечном счете, присутствие и перемещение эндосом с течением времени в пресинаптическом пространстве может быть продемонстрировано с помощью четырехмерной флуоресцентной визуализации.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что мышца живота змеи имеет толщину всего в одно волокно, что позволяет получать высококачественные изображения с помощью стандартной эпифлуоресцентной микроскопии. Ткани рептилий должны храниться при низких температурах, чтобы они оставались физиологическими в течение более длительного времени и с меньшим бактериальным загрязнением. Для лизосомального окрашивания витального красителя краситель растворяют один к 5000 в холодном растворе рептильного красителя.

Чтобы получить концентрацию 0,2 микромоля, добавьте краситель в ткань и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Через 15 минут промойте салфетку несколько раз холодными звонками на все пятна FM 1 43. Перед окрашиванием поместите образец в чашку для визуализации с магнитными штифтами.

Для целей этого видео будет продемонстрировано только окрашивание в формате FM 1 43 с использованием стимуляции хлоридом калия. Краситель, разведенный в соотношении один к 500 в колышках с высоким содержанием хлорида калия для получения конечной концентрации в семь микромоляров, добавляется в ткань, а затем ткань инкубируется при четырех градусах Цельсия в течение максимум от 30 до 60 секунд. Впоследствии быстро промывают три раза холодными кольцами примерно по одной минуте за одно полоскание.

Все ткани должны быть визуализированы как можно скорее после окрашивания и промыты холодным раствором. Если вы используете инвертированный микроскоп, используйте камеру для визуализации, дно которой содержит тонкую круглую крышку. Как правило, камера визуализации должна иметь тонкое дно из нержавеющей стали диаметром 25 миллиметров.

Стеклянная крышка первой толщины в центре для настройки подготовки к визуализации. Сориентируйте его с помощью магнитных штифтов так, чтобы мышца была как можно лучше центрирована внутри чашки для визуализации и лежала как можно ровнее. Залейте препарат небольшим объемом раствора рингера.

Установите блюдо, расположив его как можно ближе к центру сцены. Выберите подходящую цель, чтобы получить максимально возможное 3D-разрешение. Для всех экспериментов в этой демонстрации будет использоваться 63-кратный водяной объектив.

Чтобы начать эту процедуру, откройте окно визуализации в слайдбуке 5.0. Несколько меню здесь содержатся во вкладках. Выберите цель 63 x воды с помощью второй вкладки Z. Установите интервал стека Z.

В этом примере для визуализации в реальном времени используется шаг Z в 1,5 микрона. Выберите частоту кадров для интервальной съемки. Оптимальная скорость — это та, которая достаточна для плавного разрешения изменений с течением времени, таких как взаимодействие движений или события слияния.

Например, 10 временных точек на 32-м интервале для общего временного интервала в пять минут. Далее выберите общую глубину резкости при отображении терминала в реальном времени, вручную сфокусировавшись на вершине интересующего фокуса, а затем перейдите немного выше него. Выберите абонентскую приставку.

Медленно фокусируйтесь на образце, пока все не выйдет из фокуса. Опять же, количество самолетов и общее количество отображаемых значений перемещения будут указывать глубину резкости, выбранную в окне съемки. Выберите используемые радиокнопки верхнего и нижнего положения для передачи только что выбранных параметров Для захвата изображения начните захват изображения.

Выполните все снимки в реальном времени для определенного препарата. Сохранение всех файлов необработанных данных, в то время как цифровое хранение обычно не является проблемой. Время обработки имеет большое значение даже при работе с быстрыми персональными компьютерами или рабочими станциями.

По этой причине обрезка изображений в области интереса гарантирует, что вся область интереса будет находиться в обрезанном окне в течение всего времени. Курс D может включать в себя стеки изображений с использованием соответствующего программного обеспечения и правильной функции распределения точек, подтверждать, что разрешение улучшено и что алгоритм деконволюции не создает никаких артефактов. Используйте алгоритм интерполяции для расширения по оси Z.

Кажущееся разрешение, предполагает шестикратное расширение от фактического расстояния в плоскости изображения в 1,5 микрона до видимого расстояния в 0,25 микрона. Выполняйте настройку контрастной яркости, фильтрацию шума, обесцвечивание фотографий и другие типичные настройки обработки изображений. При желании.

Стандарты обработки изображений диктуют, что для большинства научных работ уместно применять одни и те же поправки ко всем изображениям как в стопке, так и в разные моменты времени. Последствия той или иной корректировки должны быть оценены по всем изображениям. Экспериментируйте с различными методами фильтрации и улучшения изображения.

Например, лело и фильтрация полезны для увеличения контраста небольших структур над фоном. Яркость пикселей в центре рабочего окна увеличивается, в то время как яркость окружающих областей уменьшается. Обратите внимание, что некоторые методы фильтрации не очень хорошо работают в сочетании.

Применяйте коррекцию дрейфа, если со временем происходит значительное смещение препарата. Такое движение является обычным явлением в живой мышце, даже при добавлении препаратов для подавления потенциалов действия и синаптических потенциалов. Алгоритм регистрации пикселей выравнивает покадровые изображения и может уменьшить, но обычно не полностью устранить такое движение.

В этом исследовании была использована визуализация нервно-мышечных окончаний змей в реальном времени, чтобы определить, движутся ли макроэндосомы или МЭ к плазматической мембране и быстро ли исчезают, предполагая, что их количество уменьшается, потому что некоторые из них получают доступ к циту. Данные отображаются в виде объемных 3D-видов в шести временных точках с интервалом кадров в 60 секунд. Чтобы проиллюстрировать глубину Z одного бутона, можно наблюдать, как me удаляется от оси Y, обозначенной красной пунктирной линией, на протяжении нескольких кадров, прежде чем исчезнуть между точками времени 5 и 6, что время, необходимое для исчезновения, было меньше, чем интервал кадров согласуется с экзоцитозом непосредственно перед исчезновением.

МЭ, по-видимому, расположен на плазматической мембране дубинок. Тот же исходный набор данных отображается далее в виде фильма с меньшим увеличением. Последовательность ненадолго приостанавливается в начале каждых 24 шагов 3D-вращения вокруг оси Y, чтобы привлечь внимание к тому, что я скоро исчезнею, обозначенное красной стрелкой.

Обратите внимание, что МЭ виден при приближении к краю бутона, исчезает и не возвращается во всех перспективах обзора. Из-за более низкого разрешения по оси Z по сравнению с разрешением XY форма ME удлиняется и укорачивается в зависимости от перспективы обзора. Исследования с помощью электронной микроскопии показали, что эндосомы в моторных терминалах имеют небольшие размеры вблизи дифракционного предела света.

Следовательно, слияние этих эндосом нельзя полностью отличить от тесной пространственной ассоциации на уровне света. В этом исследовании Мис были помечены FM 1, 43 обозначены зеленым цветом, а кислые эндосомы или НЯ были помечены лизосомой. Жизненно важные красители, обозначенные красным цветом, данные из одной временной точки четырехмерного фильма отображаются в виде объемных 3D-изображений в трех ориентациях.

На верхних панелях с первой по третью показан обычный вид сверху плоскости XY. На средних панелях с четвертой по шестую показан вид, перпендикулярный плоскости XY и в направлении большой красной стрелки. На нижних панелях с седьмой по девятую показан вид, взаимно перпендикулярный обоим видам выше в направлении большой синей стрелки.

Ме отмечена зеленой стрелкой, а две АЭ отмечены красными стрелками. Структуры, которые флуоресцировали обоими цветами и казались желтыми, иногда отмечались на четырех D-изображениях. В этом примере эндосома, содержащая оба красителя, отмечена желтой стрелкой на панелях три, шесть и девять.

Перекрытие красного и зеленого одинаково полно во всех трех ортогональных проекциях, указывающих на предполагаемое слияние em me ae. В этом ролике показан тот же набор данных, настроенный на вращение по оси Y со скоростью один кадр в секунду. Предполагаемый сплавленный MEAE остается желтым со всех точек зрения.

Цифровая деконволюция является полезным инструментом для повышения разрешения 3D, а также четырех D-изображений. Здесь показано сравнение необработанных и переданных данных. Для одного типичного нервного окончания змеиного нерва, окрашенного во время стимуляции FM 1 43 После освоения эта техника может быть выполнена за 30-60 минут при правильном выполнении.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как колокализация макроэндосом с пресинаптическими маркерами.