Разведение рыб-зебра и работа с эмбрионами

Данио-рерио представляют собой компактную, но эффективную модельную систему. Эти плодовитые рыбы способны производить сотни потомков в неделю и многие тысячи в течение жизни. Быстрое внешнее развитие и прозрачность тела делают эмбрионы идеальными для различных областей применения. В данном видео будут рассмотрены основы сбора и обращения с эмбрионами, после чего будут описаны современные методы исследований, использующие эмбрионы данио-рерио.

Для получения эмбрионов полезно знать некоторые особенности брачного поведения zebrafish.

Zebrafish размножаются половым путем, поэтому для скрещивания требуются как самцы, так и самки. Самцы имеют более стройное тело с легким красноватым оттенком, в то время как самки обладают более крупным серебристым брюшком, наполненным икрой.

Периодическое спаривание позволяет поддерживать здоровье икры, однако производство икры требует больших затрат ресурсов, поэтому каждую самку следует использовать для скрещивания не чаще одного раза в неделю.

Наконец, как и у многих других животных, брачное поведение рыб регулируется сенсорными процессами.

Ольфакторные сигналы самца помогают подготовить самку к нересту, а подходящее освещение стимулирует обоих партнеров к действию.

Научившись определять пол рыб, перейдем к организации скрещивания.

Для разведения данио-рерио исследователи используют аквариумы, специально предназначенные для спаривания. В таких аквариумах обычно имеется съемная вставка с отверстиями, через которые проваливаются икры. Эта особенность защищает икру от поедания голодными взрослыми рыбами.

Для начала поместите взрослых рыб в аквариумы для разведения во второй половине дня или вечером. Чтобы собрать эмбрионы на ранних стадиях развития следующим утром, разделите самцов и самок перегородкой, которая предотвратит их спаривание до начала эксперимента. Чтобы рыбы не выпрыгнули, обязательно накройте аквариум крышкой. Затем оставьте рыб на ночь для взаимной акклиматизации.

После совместного пребывания в нерестовом аквариуме в течение ночи рыбы спариваются на следующее утро.

Первым шагом утром является удаление перегородки между самцом и самкой для инициирования нереста. Если перегородка не использовалась, рыбы отложат икру вскоре после включения света.

Когда самцы преследуют самок по аквариуму, они стимулируют откладку икры, одновременно выбрасывая сперму в воду для оплодотворения. После удаления перегородки подождите примерно 15 - 30 минут, чтобы дать рыбам время для спаривания. Затем извлеките взрослых особей из аквариума с помощью сачка или, подняв вставку аквариума, перенесите рыб в другой резервуар.

Затем пролейте воду с эмбрионами через сетчатое ситечко для их сбора. После этого, используя «икру-воду», смойте эмбрионы с ситечка в чашку Петри. Может потребоваться перенести эмбрионы между чашками для достижения оптимальной плотности 50 - 100 штук на чашку. Чтобы развитие шло с нормальной скоростью, поместите чашки в инкубатор при температуре 28.5 °C.

После получения эмбрионов обращайтесь с ними осторожно. Они имеют решающее значение для ваших экспериментов! Рассмотрим основные рекомендации.

Чтобы эмбрионы оставались здоровыми, следите за тем, чтобы вода в чашках Петри была чистой и не содержала посторонних частиц. Погибшие эмбрионы становятся непрозрачными, их следует удалять ежедневно. Кроме того, в воду можно добавить метиленовый синий для предотвращения роста грибков.

При необходимости переместить эмбрионы из одной чашки в другую используйте переносную пипетку. Вращая чашку, можно собрать эмбрионы в центре планшета, что облегчит их отбор пипеткой.

Некоторые протоколы требуют дополнительных этапов содержания эмбрионов. В первые три дня жизни эмбрионы zebrafish развиваются внутри хориона, который может затруднять манипуляции с эмбрионом. Хорион можно удалить путем обработки протеолитическим ферментом проназой или вручную с помощью пинцета. Кроме того, к 24 часам у zebrafish начинает развиваться пигментация, как показано здесь на примере личинки zebrafish, что может помешать микроскопии. Чтобы решить эту проблему, ученые добавляют в воду с эмбрионами PTU, который ингибирует выработку пигмента меланина.

Теперь, когда вы знаете, как получать эмбрионы zebrafish и ухаживать за ними, давайте рассмотрим некоторые способы их использования исследователями для научных открытий.

Внешнее развитие эмбрионов zebrafish позволяет осуществлять генетические манипуляции путем микроинъекций ДНК, РНК или реагентов для нокдауна генов. Этот метод обеспечивает равномерное распределение введенного материала по всему эмбриону и может привести к появлению видимых фенотипов, возникающих в результате гиперэкспрессии или отсутствия белка. Тот же метод может быть использован для создания трансгенных рыб, в которых специфические структуры маркированы экспрессией флуоресцентных белков.

Кроме того, малый размер эмбрионов и личинок zebrafish делает их идеальными объектами для химического фенотипического скрининга. В данном случае эмбрионы помещают в 96-луночные планшеты, после чего обрабатывают библиотеками малых молекул, добавляя химические вещества в воду. Впоследствии такие планшеты с рыбами проверяют на наличие морфологических дефектов, таких как показанное здесь аномальное развитие.

Наконец, прозрачность эмбрионов zebrafish делает их подходящими для микроскопии. Живые эмбрионы, экспрессирующие флуоресцентные белки в определенных типах клеток, могут быть закреплены и визуализированы с помощью конфокальной микроскопии, что позволяет исследователям наблюдать за перемещением клеток в развивающихся тканях с течением времени.

Вы только что посмотрели видео JoVE о разведении zebrafish и работе с эмбрионами. В этом видео мы обсудили основы спаривания, обустройство нерестовых аквариумов и правила обращения с эмбрионами. Мы также рассмотрели некоторые методы исследований, в которых используются преимущества этого удивительного маленького эмбриона. Спасибо за просмотр!