Рестриктазой основе Клонирование метод оценки В пробирке Репликация Емкость ВИЧ-1 подтипа С Gag-MJ4 химерных вирусов

Общей целью этой процедуры является включение генов gag, полученных от инфицированных подтипа CHIV 1, в репликационно-компетентную ВИЧ-одну плазмиду. Чтобы оценить влияние полиморфизмов последовательности gag на способность к репликации ВИЧ in vitro, это достигается путем первичной амплификации гена gag из плазмы пациента. Вторым шагом является клонирование полученной от пациента последовательности gag в компетентный инфекционный молекулярный клон MJ 4.

Затем плазмида химеры MJ MJ four трансфицируется для получения инфекционных вирусных запасов и титрируется для оценки инфекционности на индикаторной клеточной линии. Последним шагом является измерение способности к репликации in vitro в Т-клеточной линии G XR 25. В конечном счете, анализ обратной транскриптазы с радиометкой используется для количественной оценки продукции вириона с течением времени с целью визуализации кинетики репликации вируса.

Метод, который мы опишем сегодня, может помочь ответить на ключевые вопросы в области ВИЧ. К ним относятся определение детерминант репликативной приспособленности ВИЧ и понимание того, как приспособленность ВИЧ влияет на долгосрочный патогенез. Описывать методы сегодня будут Джессика Принс и Дэн Клабан, двое моих аспирантов.

Чтобы начать эту процедуру, необходимо провести обратную транскрибацию КДНК из РНК и амплификацию продуктов ДНК первого раунда с использованием обратной транскриптазы и термостабильной ДНК-полимеразы в одноэтапной ПЦР ОТ. Затем, используя один микролитр первого раунда ПЦР-амплификации в качестве матрицы ДНК, проводят вложенную ПЦР-амплификацию второго раунда. Далее добавьте три микролитра пяти х загрузочного красителя к пяти микролитрам второго круга реакционного объема.

Запустите его при напряжении 120 вольт на 1%-ном геле TAE, содержащем УФ-флуоресцентное окрашивание ДНК, пока полосы не исчезнут. Затем визуализируйте полосы размером 1,6 КБ на синем световом осветителе. После этого запустите оставшийся объем реакции 45 микролитров на 1%-ный гель TAE, содержащий краситель ДНК.

Вырежьте соответствующие ленты чистым лезвием бритвы и объедините три положительные реакции на одну особь. Затем извлеките ДНК из гелевого среза с помощью набора для очистки геля и поместите его в воду, свободную от нуклеаз. Заморозьте продукт при температуре минус 20 градусов Цельсия для использования в дальнейшем в этой процедуре.

После амплификации длинного терминала повторяют пять простых UTR областей MJ из четырех плазмид. Визуализируйте продукты ПЦР размером 1,3 КБ на осветителе, удалите положительные ампликоны, затем очистите и заморозьте их, как описано ранее. Затем создайте слитые ампликоны MJ four LTR gag с помощью ПЦР с расширением перекрытия сплайсинга.

Визуализировать, вырезать, очищать и замораживать ампликон длиной 3,2 кб. Теперь расщепите 1,5 мкг MJ 4 плазмиды и 1,5 мкг очищенного продукта ПЦР LTR gag с эндонуклеазой рестрикции BCL one в течение 1,5 часов при 50 градусах Цельсия. Впоследствии добавьте один микролитр НГОМ четыре в реакцию пищеварения и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

После этого добавьте пять х х загрузку красителя для реакции реакции рестрикции переваривания. Медленно электрофорез общего объема на 1%-ном геле TAE, содержащем окрашивание ДНК в течение одного-двух часов при напряжении 100 вольт. Визуализировать, вырезать и очистить указанные полосы для клонирования, как описано ранее.

Далее приготовьте реакции лигирования с использованием очищенного кляпа LTR. Вставьте четырехвекторную ДНК MJ с соотношением вставки к вектору три к одному. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем преобразуйте JM 1 0 9 химически компетентные бактерии с продуктами лигирования, распределенными по 100 микрограмм на миллилитр. Ампициллин выращивает трансформированные бактерии при температуре 30 градусов Цельсия в течение не менее 22 часов. Чтобы подтвердить верность клонирования, разрежьте мини-преп-ДНК с помощью ферментов рестрикции NGO M four и HPA one в двойном расщеплении при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.

После этого проанализируйте его на 1%aros. Гель ТАЕ. Рассчитайте необходимый объем вируса из каждого запаса на основе титра МЕ на микролитр из анализа клеток TZM BL для того, чтобы заразить пять раз по 10 до пятой G XR две пять клеток при кратности инфекции 0,05.

Обязательно надевайте надлежащие средства индивидуальной защиты для работы с репликацией грамотного ВИЧ, которые включают в себя полный халат, маску для лица и двойные перчатки в день заражения. Достаньте вирусные запасы из морозилки минус 80 градусов по Цельсию и разморозьте. Далее разведите вирус в средах C-R-P-M-I до объема 100 микролитров.

Чтобы получить 0,05 MOI, добавьте его в обработанную 96-луночную культуру тканевой культуры vbo, включая как положительный, так и отрицательный контроль в каждой серии экспериментов по репликации, и установите планшет таким образом, чтобы каждая вторая колонка была пустой, чтобы ограничить перекрестное загрязнение между лунками. После этого пересчитайте GXR две пять клеток с помощью автоматического счетчика клеток и рассчитайте общее количество клеток, необходимое для всех инфекций. Наберите необходимый объем в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугите для гранулирования ячеек.

Затем тщательно отасканируйте среду и ресуспендируйте в C-R-P-M-I в концентрации пять умно-10 на пятую клетку на 100 мкл, пипетируйте клетки в стерильное корыто и тщательно перемешайте. Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте по 100 микролитров клеток в каждую лунку из 96-луночной пластины, содержащей разведенный вирус, и тщательно перемешайте. После этого добавьте в каждую лунку по два микролитра по пять миллиграмм на миллилитр раствора полимозга и тщательно перемешайте клетки.

Затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для культур тканей с 5% CO2 в течение трех часов, чтобы промыть зараженные клетки центрифугой. Нижняя пластина на 96 лунок V для гранулирования ячеек. Затем осторожно удалите 150 микролитров среды и замените на свежие 150 микролитров C-R-P-M-I, не нарушая клеточную гранулу.

Повторите процедуру еще два раза, чтобы достаточно промыть клетки после последнего центрифугирования и добавления 150 микролитров C-R-P-M-I ресуспендировать клеточную гранулу многоканальной пипеткой. Добавьте смесь из каждой лунки до 800 микролитров C-R-P-M-I в лунку 24-луночного планшета для культуры тканей. Затем поместите планшет в инкубатор для культуры тканей с содержанием 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия каждые два дня.

Перенесите 100 микролитров надосадочной жидкости с поверхности культуральной лунки в лунку 96 луночной нижней пластины и заморозьте для последующего анализа с помощью РТ-анализа, после чего тщательно повторно суспендируйте клетки и удалите половину оставшегося объема для предотвращения разрастания клеток. После этого восстановите первоначальный объем, добавив в каждую лунку по 550 микролитров свежего C-R-P-M-I в каждую лунку, в эту процедуру добавьте один-два микролитра 10 милликюри на миллилитр DTTP и четыре микролитра одного молярного ДИО трех этолов на каждый миллилитр аликвоты ourt master mix. Тщательно перемешайте каждую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра RT master mix DTT и DTTP с пипеткой объемом 1000 микролитров и переложите в стерильное корыто.

Далее выдают 25 микролитров маркированного RT. Перемешайте в каждой лунке 96 луночный тонкостенный ПЦР-планшет. Добавьте по пять микролитров каждой надосадочной жидкости в ПЦР-планшет, содержащий мастер-смесь RT. Затем запечатайте ПЦР-планшет клейкой крышкой из фольги и выдержите в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия в термоамплификаторе после инкубации, сделайте небольшие отверстия в крышке из фольги с помощью многоканальной пипетки объемом 200 микролитров.

Перемешайте образцы пять раз. Переложите пять микролитров каждого образца на бумагу DE 81 и дайте всем образцам высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Поместите кляксы в отдельные емкости для мытья.

Впоследствии промойте кляксы пять раз одним XSSC. Затем два раза с 90% этанолом в течение пяти минут за стирку, прежде чем дать им высохнуть на воздухе. После высыхания осторожно заверните кляксу в пленку Саран и подвергните воздействию фосфосного экрана в плотно закрытой кассете на ночь при комнатной температуре.

Когда все будет готово, проанализируйте фосфоэкраны с помощью фосфовизора и количественно оцените радиоактивные транскрипты. Показывать. Ниже приведены репрезентативные изображения геля, изображающие электрофоретическое разделение различных ампликонов ПЦР, необходимое для создания ампликона гага, полученного от пациента, способного быть клонированным в четырехплазмидный остов MJ. На этом репрезентативном изображении геля показано электрофоретическое разделение рестрикционных расщеплений для клонирования генов гага пациента в MJ 4.

И это репрезентативное изображение геля изображает электрофоретическое разделение рестрикции, переваривает очищенный кляп MJ четырьмя химерами плазмидной ДНК. На этом графике показана воспроизводимость анализа репликации с течением времени в линии G XR two five. Один и тот же gag MJ, четыре химерных вируса, были использованы для заражения G XR двух пяти клеток в двух независимых экспериментах, проведенных с интервалом примерно в один год.

Оценки репликации были получены путем вычисления наклона логарифмически преобразованных значений DLU и нормализации этого наклона до дикого типа MJ 4. Эти два независимых измерения тесно коррелируют и подчеркивают воспроизводимость анализов, выполненных в разное время и с клетками в разных пассажах. Этот метод проложил путь исследователям в области ВИЧ/СПИДа к изучению вирусных детерминант патогенеза.

При острой инфекции подтипа С, наиболее распространенном подтипе во всем мире. Работа с компетентной репликацией ВИЧ может быть чрезвычайно опасной. Все шаги, связанные с живым вирусом, должны выполняться в учреждении BSL два плюса.

Все поверхности должны регулярно дезинфицироваться и постоянно носить двойные перчатки.