Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Общая цель данной процедуры — определить этапы, на которых химическое воздействие влияет на экспрессию вирусных генов. Для этого клетки культуры тканей высевают и инкубируют до достижения конфлюэнтности. Затем клетки заражают либо вакцинийным вирусом с тройным репортером, либо контрольным вирусом без промотора.

Затем наносятся исследуемые соединения, и клетки инкубируют в течение 18 часов, чтобы обеспечить завершение всех стадий экспрессии вирусных генов. После этого уровень полученной флуоресценции определяют с помощью планшетного ридера. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие относительные изменения экспрессии, вызванные экспериментальными соединениями.

Основное преимущество данной методики по сравнению с инфицированием вирусом, экспрессирующим один флуоресцентный слитый белок, заключается в том, что данный набор вирусов предоставляет больше информации о том, на каком этапе жизненного цикла вируса действует конкретный терапевтический препарат, что позволяет глубже понять механизм его действия. Хотя этот метод может быть использован для идентификации ингибиторов вирусной инфекции, он также применим для определения стадии вирусной репликации, завершаемой в непермиссивных клеточных линиях или при скрининге с помощью РНК-интерференции (RNAi), что позволяет выявить клеточные факторы, необходимые для инфицирования. В данном протоколе используется многостадийный репортерный вирус TrpV (triple virus), в двухцепочечный геном которого одного вируса vaccinia встроены три спектрально различающихся флуорофора.

Каждый из этих флуорофоров контролируется определенным промотором, специфичным для конкретной стадии. Промотор C 11 R обеспечивает раннюю экспрессию Venus, промежуточный промотор G восемь R — экспрессию m-cherry, а промотор F 17 R — экспрессию tag BFP на поздней стадии. Таким образом, Venus, m-Cherry и tag BFP экспрессируются последовательно в процессе инфекции.

В качестве контроля используется вирус без промотора. PLV содержит конструкцию Venus, аналогичную той, что находится в TrpV, однако он не имеет функционального промотора транскрипции.

Начните выполнение данного протокола с диссоциирования клеток Hela, выращенных в чашке диаметром 10 см. Разведите клетки в ростовой среде до концентрации примерно 2,0 × 10⁵ клеток/мл. Затем внесите по 100 µL в каждую лунку 96-луночного планшета с черными стенками, прозрачным плоским дном. Инкубируйте клетки в течение 24 часов в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до достижения конфлюэнтности. Для разведения вирусов разморозьте TrpV и PLV на водяной бане при 37 °C, затем подвергните воздействию ультразвука в течение пяти минут для деагрегации. Далее разведите вирусный сток до концентрации 1,0 × 10⁷ PFU/мл в инфекционной среде, предварительно нагретой до 37 °C.

Для заражения клеток замените ростовую среду в каждой лунке на 50 µL разведенного вируса. Для каждого варианта обработки заразите три повторности вирусом TrpV и еще три — вирусом PLV, чтобы учесть фоновую флуоресценцию, специфичную для каждого варианта. Этот момент считается временем, равным нулю часов после заражения. Например, приготовьте 350 µL раствора для 6 лунок 96-луночного планшета по 50 µL в каждую. Каждый препарат должен быть разведен до концентрации, в два раза превышающей конечную, поскольку он будет добавлен к объему инокулята, уже находящемуся в лунке. Затем для каждого условия обработки приготовьте двухкратный (2x) мастер-микс, разведенный экспериментальными соединениями или растворителями контрольной группы (например, PBS или DMSO) в достаточном количестве инфекционной среды для всех повторностей плюс одна дополнительная. Обратите внимание, что концентрация растворителя в экспериментальных группах и в контроле с одним лишь вектором должна быть одинаковой. Например, если вы используете IBT в концентрации 1 µL/mL в DMSO, в качестве векторного контроля следует использовать чистый DMSO в концентрации 1 µL/mL. Сразу после добавления вируса добавьте в каждую лунку по 50 µL инфекционной среды, содержащей соответствующие препараты для обработки и контрольные соединения, как показано на данной иллюстрации.

Обратите внимание, что каждое соединение тестируется с TrpV и PLV в трех повторностях, а контрольный образец с растворителем также обрабатывается в трех повторностях для каждого вируса.

Инкубируйте в течение 18 часов в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. На следующий день зафиксируйте клетки, добавив по 100 µL 8% параформальдегида в среду для инфицирования в каждую лунку. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 15 минут в защищенном от света месте.

Добавление 2x или 8% параформальдегида непосредственно в среду для инфицирования предотвратит аэрозолизацию вируса, которая может произойти при сливании нефиксированного вируса в емкость для отходов. По истечении 15 минут удалите фиксатор, перевернув планшет над емкостью для отходов. Затем добавьте 100 µL PBS комнатной температуры и загерметизируйте планшет оптически прозрачной адгезивной пленкой.

Если планшет не будет считан немедленно, храните его при температуре четыре градуса Celsius. Обязательно доведите запечатанные планшеты до комнатной температуры перед считыванием, чтобы предотвратить образование конденсата, который может исказить измерения спектрофотометра.

Для количественного определения роста вируса используйте спектрофотометр для измерения конечной флуоресценции. Выполните по четыре измерения в каждой лунке, используя оптимизированные настройки усиления для каждого канала. Планшетный ридер TECAN Infinite M 1000 Pro, используемый в данном видео, экспортирует необработанные данные измерений флуоресценции в файл Microsoft Excel. После получения показаний откройте необработанные данные в Microsoft Excel.

Затем скопируйте и вставьте данные в таблицу результатов GraphPad Prism. В Prism определите среднее значение для повторностей в лунках TrpV и PLV. Затем для каждого варианта обработки вычтите среднее значение PLV из среднего значения TrpV. Для облегчения сравнения с повторными экспериментами нормализуйте данные, разделив значения за вычетом фона на значения в лунках TrpV с одним только растворителем. После многократного повторения эксперимента проведите однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) и последующий тест на множественные сравнения, чтобы определить, значимо ли отличаются какие-либо варианты обработки от обработки DMSO для каждого канала. Для проведения кинетических анализов инфицируйте клетки и нанесите исследуемые соединения, как описано выше; при этом особенно важно использовать буферную среду для поддержания надлежащего pH без добавления 5% carbon dioxide.

После запечатывания планшета адгезивной пленкой поместите его в камеру планшетного ридера, термостатированную при 37 °C. Необходимо уделить особое внимание поддержанию постоянной температуры планшетов на уровне 37 °C. Это позволит избежать чрезмерного стресса клеток и образования конденсата.

Вручную установите усиление планшетного ридера, чтобы предотвратить насыщение сигнала на более поздних временных точках. Выполняйте измерения каждый час в течение восьми-24 часов после инфицирования и проведите нормализацию, как при проведении конечного анализа. Отдельные временные точки могут быть проанализированы на предмет статистической значимости с использованием методов, аналогичных тем, что были описаны для конечного анализа.

Для сравнения точек ингибирования клетки HeLa, инфицированные вакцинией TrpV или PLV, выращивали в присутствии ингибиторов оспиных вирусов: AraC, IBT, рифампицина и ST 246. В данном видео в режиме таймлапс показана последовательная экспрессия зеленых, красных и синих флуорофоров в процессе роста вируса в контрольных клетках. При инфицировании в присутствии AraC, препарата, блокирующего репликацию ДНК, ранний зеленый флуорофор вырабатывается так же, как и прежде, однако промежуточная и поздняя продукция красной и синей флуоресценции не происходит.

Количественный анализ методом спектрометрии показал увеличение экспрессии ранних генов на 210%, однако в клетках, обработанных araC, отсутствовала промежуточная и поздняя экспрессия. В клетках, инфицированных в присутствии IBT, который, как полагают, способствует сквозной транскрипции, уровни промежуточной и поздней экспрессии составили 24,7% и 2,9% от контрольных уровней соответственно. Клетки, инфицированные в присутствии ST246 и рифампицина, которые ингибируют экспрессию после поздних генов во время сборки и созревания вирионов, существенно не отличались от контрольных групп. Эти результаты согласуются с известным механизмом действия данных соединений и позволяют предположить, что репортерный вирус TrpV может быть использован для определения конкретной стадии вирусного ингибирования для неизвестных соединений.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости включения соответствующих контролей. Это позволяет не только правильно нормализовать результаты, но и определить потенциальный механизм действия вашего исследуемого соединения. Не забывайте, что работа с вирусом вакцины может быть крайне опасной, поэтому всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и соблюдайте рекомендуемые методы сдерживания для уровня биобезопасности BSL-2.