Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении стадий, на которых химическая обработка влияет на экспрессию вирусных генов. Для этого клетки тканевой культуры покрывают и инкубируют. До тех пор, пока клетки не сличатся, их заражают либо тройным репортерным вирусом коровьей оспы, либо вирусом контрольного списка.

Затем применяются лечебные соединения, и клетки инкубируются в течение 18 часов, чтобы обеспечить завершение всех стадий экспрессии вирусных генов. Результирующая флуоресценция затем определяется с помощью планшетного ридера. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают относительные изменения в экспрессии, вызванные экспериментальными соединениями.

Основное преимущество этой методики по сравнению с вирусом, экспрессирующим один флуоресцентный гибридный белок, заключается в том, что этот набор вирусов дает больше информации о том, на каком этапе жизненного цикла вируса действует конкретный терапевтический препарат, что дает представление о механизме его действия. Хотя этот метод может быть использован для идентификации ингибиторов вирусной инфекции, он также может быть использован для выявления стадии репликации вируса, завершенной в непермиссивных клеточных линиях или в скрининге РНК-интерференции, выявляя клеточные факторы, необходимые для инфекции. В этом протоколе используется тройной вирус или многоступенчатый репортерный вирус Trip V, в котором три спектрально различных флюорочетвера включены в двухцепочечный геном одного вируса venia.

Каждая из этих флюорочетверов контролируется четко определенным промотором, специфичным для стадии. Промотор C 11 R для ранней экспрессии Venus, промежуточный промотор G eight R для экспрессии m cherry и промотор F 17 R для поздней стадии экспрессии метки BFP. Таким образом, Venus m Cherry и метка BFP последовательно экспрессируются во время инфекции.

В качестве контроля используется вирус со списком промоутеров. PLV содержит венозную конструкцию, аналогичную той, что используется в Trip V. Однако она не имеет функционального промотора транскрипции. Начните этот протокол с диссоциации.

Хела клетки выращивают на 10-сантиметровой тарелке, разводят клетки в питательной среде примерно до 2,0 раз 10 до пятой клетки на миллилитр. Затем дозируйте по 100 микролитров в каждую лунку с черными стенками из прозрачного плоского дна 96-луночной пластины, инкубируйте клетки в течение 24 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, пока они не слится для разбавления вирусов, разморозьте Tripp V и PLV на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, затем обрабатывайте ультразвуком в течение пяти минут для дезагрегации. Затем разбавьте запас вируса до 1,0 умножить на 10 до седьмого PFU на миллилитр в инфекционной среде, предварительно прогретой до 37 градусов Цельсия для заражения клеток.

Замените питательную среду на 50 микролитров разведенного вируса в каждую лунку для каждой обработки. Инфицируйте три реплицируемые лунки Tripp V и еще три с помощью PLV, чтобы учесть фоновую флуоресценцию, специфичную для каждой обработки. Это определяется как время, равное нулю часов.

После заражения, например, делают 350 микролитров на 6 96 лунок по 50 микролитров в каждой. Каждое соединение следует разбавлять до двукратной конечной концентрации, так как оно будет добавляться в объем посевного материала уже в лунке. Затем для каждого условия обработки сделайте двухкратную мастер-смесь, разбавив экспериментальные соединения или растворители для управления транспортными средствами, такие как PBS или ДМСО, в достаточном количестве инфекционной среды для всех реплик.

Плюс первый, обратите внимание, что концентрация растворителя как в экспериментальном, так и в векторном контроле должна быть одинаковой. Например, если вы используете IBT в концентрации один микролитр на милл в DMSO, вам также следует использовать только DMSL в концентрации один микролитр на миль в качестве векторного контроля. Сразу после добавления вируса добавьте в каждую лунку по 50 микролитров инфекционной среды, содержащей необходимые лечебные и контрольные соединения, как показано на этом рисунке.

Обратите внимание, что каждое соединение тестируется с Tripp V и PLV в трех экземплярах, а контроль транспортного средства проводится в трех экземплярах для каждого вируса. Инкубировать в течение 18 часов в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия плюс 5% углекислого газа. На следующий день закрепите клетки, добавив в инфекционную среду 100 микролитров 8%-ного параформного альдегида, уже в каждой лунке инкубируйте тарелку при комнатной температуре в течение 15 минут в защищенном от света месте.

Добавление двух x или 8%-ного параформного альдегида непосредственно в инфекционную среду предотвратит распыление вируса, которое в противном случае могло бы произойти, если незафиксированный вирус будет непосредственно инвертирован в посуду для отходов. По прошествии 15 минут снимите фиксатор, перевернув пластину в отработанную посуду. Затем добавьте 100 микролитров PBS комнатной температуры и заклейте пластину оптически прозрачной клейкой пленкой.

Если табличка не будет считываться сразу, храните ее при температуре четыре градуса Цельсия. Перед считыванием показаний обязательно верните герметичные пластины к комнатной температуре, чтобы предотвратить искажение измерений спектрофотометра из-за конденсации. Чтобы количественно оценить рост вируса, используйте спектрофотометр для измерения флуоресценции конечной точки.

Выполните четыре измерения для каждой лунки с использованием оптимизированных настроек усиления для каждого канала. Считыватель пластин TAN Infinite M 1000 Pro, используемый в этом видео, экспортирует необработанные флуоресцентные измерения в файл Microsoft Excel. После того, как показания были получены, откройте исходные данные в Microsoft Excel.

Затем скопируйте и вставьте его в призму GraphPad. Лист результатов в Prism определяет среднее значение повторяющихся скважин Tripp v и PLV. Затем вычтите среднее значение PLV из среднего значения Tripp V для каждой процедуры.

Чтобы облегчить сравнение с повторными экспериментами, нормализуйте данные, разделив фоновые вычитаемые данные на транспортное средство только Трипп против Уэллса. После того, как эксперимент был повторен несколько раз, проведите односторонний дисперсионный анализ или односторонний тест NOVA и многократное сравнение после теста, чтобы определить, значительно ли какое-либо из методов лечения отличается от лечения ДМСО. Для того, чтобы каждый канал проводил кинетические анализы, инфицировал клетки и применял тестируемые соединения, как и раньше, особенно важно использовать буферную среду для поддержания надлежащего pH без добавления 5% углекислого газа.

После запечатывания пластины клейкой пленкой, поместите ее в камеру считывателя пластин, уравновешенную до 37 градусов Цельсия. Особое внимание должно уделяться тому, чтобы пластины постоянно держались при температуре 37 градусов по Цельсию. Это предотвратит чрезмерное напряжение клеток и конденсацию.

Вручную установите усиление считывателя пластин, чтобы предотвратить насыщение более поздних временных точек. Получайте почасовые показания в течение восьми-24 часов после заражения и нормализуйтесь. Что касается анализа конечной точки, отдельные временные точки могут быть проанализированы на статистическую значимость с использованием методов, аналогичных ранее описанному анализу конечных точек.

Для сравнения точек ингибирования клетки пятки, инфицированные TPV или PLV, выращивали в присутствии ингибиторов вируса оспы, Aris, CIBT, Rifampicin и ST 2 46. На этот раз в фильме показана последовательная экспрессия зеленой, красной и синей флюорочетверок во время роста вируса в контрольных клетках при заражении в присутствии препарата, блокирующего репликацию ДНК aee. Ранняя зеленая флюоресцентная четверка получается так же, как и раньше, но промежуточная и поздняя выработка красной и синей флуоресценции не происходит.

Количественный анализ с помощью спектрометрии показал увеличение экспрессии генов на ранних этапах на 210%, но отсутствие промежуточной и поздней экспрессии в клетках, обработанных С-клетками, инфицированными в присутствии IBT, которая, как считается, способствует. Прочитанная транскрипция имела промежуточные и поздние уровни экспрессии, которые составляли 24,7%, и 2,9% от контрольных уровней. Эти результаты согласуются с понятным механизмом действия этих соединений и позволяют предположить, что репортерный вирус Trip V может быть использован для идентификации специфической стадии вирусного ингибирования неизвестных соединений.

При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать включать соответствующие элементы управления. Это позволяет не только правильно нормализовать результаты, но и определить потенциальный механизм для вашего экспериментального соединения. Не забывайте, что работа с вирусом коровьей оспы может быть чрезвычайно опасной, всегда надевайте надлежащие средства индивидуальной защиты и соблюдайте рекомендованные bsl.

Два метода сдерживания.