Мышь Модель для патогенных микроорганизмов, вызванной хроническим воспалением на локальном и системном сайтов

Общая цель данного протокола заключается в изучении влияния микробной инфекции на хроническое воспаление in vivo с использованием физиологически значимой животной модели. Это достигается путем перорального инфицирования мышей Porphyromonas gingivalis для индуцирования местного и системного хронического воспаления. Затем МРТ может быть использована для измерения прогрессирования системного воспаления у живых животных, в то время как местная воспалительная потеря костной массы оценивается с помощью микрокомпьютерной томографии, а атеросклеротические бляшки могут быть визуализированы путем окрашивания липидов на лице после жертвоприношения.

В конечном счете, различия в объеме альвеолярной кости и накоплении атеросклеротических бляшек между мышами, инфицированными P. gingivalis, и неинфицированными контрольными группами могут быть измерены на основе микрокомпьютерной томографии и окрашивания липидов лица соответственно. Основное преимущество нашей животной модели заключается в том, что она позволяет исследовать как хозяина, так и патогенные механизмы, участвующие в хроническом воспалении, в частности, в местах, удаленных от инфекции. Таким образом, вы можете посмотреть на системные участки, а также на локальные очаги инфекции с использованием трансгенных мышей и определенных бактериальных мутантов.

Эта модель может помочь определить ключевые аспекты патогенеза, такие как факторы хозяина и микроорганизмы, способствующие заболеванию. Хотя этот метод может дать представление о специфических механизмах хозяина и патогена, участвующих в воспалительной потере костной массы и атеросклерозе, он также может быть адаптирован для других мышиных моделей заболеваний, включая ревматоидный артрит, диабет и рак. Это высокопольное ядро МРТ для Бостонского университета, и мой постдок Нинг собирается продемонстрировать аспекты визуализации у мышей: начните с нанесения полос замороженных стеблей персика десны 3 81 на анаэробные кровяные агаровые пластины и инкубируйте пластины в анаэробной камере при температуре 37 градусов по Цельсию.

Через три-пять дней используйте выращенные в планшете организмы для инокуляции пяти миллилитровых жидких культур инфузионного бульона для мозга и сердца, или BHI. После ночного роста перенесите культуры в 45 миллилитров BHI и инкубируйте культуры анаэробно еще от 18 до 24 часов. В середине логарифмической фазы соберите бактерии центрифугированием в течение 10 минут при 7000 GS и комнатной температуре, а затем тщательно повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах PBS с помощью серологической пипетки, промыв гранулу три раза в 50 миллилитрах PBS Resus, гранулу в PBS таким образом, чтобы разведение культуры один к 10 имело оптическую плотность 1,0 при 660 нанометрах.

Затем выведите достаточное количество карбоксиметилцеллюлозы средней вязкости для достижения 2% веса к объему раствора и медленно добавьте этилцеллюлозу carbox в бактериальную суспензию во время вортекса, чтобы избежать комкования. Измерить прогрессирование воспаления в С-два. Сначала поместите держатель для животных с головой мыши в лежачем положении в 30-миллиметровый вертикальный зонд и в вертикальное отверстие сканера TMRI 11,7

После процессов колебания и шимминга используйте редкую последовательность для получения скаутских изображений вдоль трех ортогональных ориентаций для создания аксиальных корональных и сагиттальных изображений. Затем, после использования магнитно-резонансной ангиографии низкого разрешения для подтверждения того, что полученные изображения находятся в пределах целевой области, выполните магнитно-резонансную ангиографию безымянной артерии с высоким разрешением с необработанной 3D градиентной эхо-последовательностью с использованием следующих параметров. Толщина плиты 1,5 сантиметра, угол поворота 45 градусов, время повторения 20 миллисекунд, время эхо-сигнала 2,2 миллисекунды, поле зрения 1,5 на 1,5 на 1,5 сантиметра, матрица 1 28 на 1 28 на 1 28 и среднее число четыре для общего времени сканирования примерно 22 минуты.

Затем выберите аксиальное изображение номинальной артерии на 0,3–0,5 миллиметра ниже подключичной бифуркации для анализа ROI. Начните с укладки аорты в анатомическое положение с луковицами аорты слева. Затем поместите временные штифты мнучин последовательно в следующих пяти местах: верхняя часть аорты ниже третьей ветви дуги, середина нисходящей аорты рядом с нижним концом нисходящей аорты и выше ветви бедренной артерии.

Затем используйте очень тонкие пружинные ножницы, чтобы разрезать левую сторону аорты, начиная с левой ветви бедренной артерии и заканчивая нижней ветвью восходящей аорты. Затем после среза и прищипывания каждой ветки, чтобы обнажить ее внутреннюю поверхность, продолжайте прикалывать ткань. Вся внутренняя поверхность открыта и хорошо видна сверху и свободна от визуальных помех от штифтов.

Чтобы окрасить липиды и количественно оценить повреждения, начните с покрытия перфорированной аорты свежеприготовленным раствором Sudan four или масляным красным раствором O. Через 50 минут промойте ткань с 70% изопропанолом в течение одной-пяти минут, а затем аккуратно промойте аорту двойной дистиллированной водой, пока вода, стекающая с ткани, не перестанет быть красной. Затем закройте аорту PBS и положите линейку рядом с тканью, чтобы помочь в калибровке изображения.

Затем сделайте снимки ткани с помощью камеры высокого разрешения, прикрепленной к препарирующему микроскопу, сохранив изображения в формате TIFF. Наконец, в программном обеспечении для анализа изображений вручную отслеживайте каждую интимную поверхность, чтобы определить ее площадь. Затем, чтобы рассчитать площадь поражения с помощью автоматического цветового порога, установите порог для каждого изображения, чтобы определить интенсивность цвета, которая отличает поражения от нормальных областей.

Процент поверхности интимы, покрытой атеросклеротическими поражениями, может быть рассчитан в этом репрезентативном эксперименте с мышами, инфицированными P. gingivalis. Объемный анализ показал, что инфицированные мыши демонстрируют значительную потерю костной массы по сравнению с неинфицированными контрольными группами. Визуальный осмотр реконструированной верхней челюсти Hemi свидетельствует об увеличении площади открытой поверхности коренных корешков у инфицированных мышей по сравнению с контрольной группой, склонной к атеросклерозу.

Мышей с дефицитом POE. P. gingivalis вызывает хроническое воспаление, которое приводит к потере альвеолярной костной ткани и отложению воспалительных бляшек в аортальном синусе и номинальной артерии уже через 24 часа после последней инфекции, что можно контролировать у живых мышей с помощью серийных in vivo, МРТ в различные моменты времени после заражения, как на этих репрезентативных изображениях. Кроме того, измерения лица Судана с четырьмя пятнами аорты показывают, что инфекция p. gingivalis значительно увеличивает отложение липидов и пораженные участки на поверхности интимы.

Кроме того, иммуногистохимический анализ поражений синусовых пазух аорты выявляет повышенную инфильтрацию микрофагов и повышенную экспрессию врожденного иммунного рецептора толл-лайк рецептора двух внутривенных вливаний у инфицированных мышей. При попытке проведения этой процедуры важно учитывать, что временные точки продолжительности эксперимента, в которых оценивается воспаление, должны соответствующим образом соответствовать прогрессированию заболевания. После МРТ других пациентов могут быть выполнены другие методы, такие как стояние на лице или иммунная гистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как глобальная атеросклеротическая нагрузка или клеточные компоненты поражения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о модели мыши in vivo, которая позволяет исследовать как хозяин, так и патогенные факторы, участвующие в хроническом воспалении. Не забывайте, что работа с патогенными микроорганизмами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как правильное использование СИЗ.