Легких крупного рогатого скота в биомедицинских исследований: Визуально Руководствуясь Бронхоскопия, внутрибронхиального Прививка и

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении взаимодействий между хозяином и патогеном на бычьей модели респираторной инфекции. Это достигается путем индуцирования респираторной инфекции у телят посредством внутрибронхиального введения соответствующего патогена с последующим наблюдением за течением заболевания. Образцы многократно забирают у животного с помощью бронхоальвеолярного лаважа.

Затем проводят бронхиальное браширование и трансбронхиальную биопсию легких для получения эпителиальных клеток и образцов альвеолярной или легочной ткани соответственно. В конечном итоге специфическое респираторное заболевание, вызванное патогеном, может быть подтверждено, например, по воспалительным изменениям в лаваже, данным цитологии и путем иммуногистохимического обнаружения патогена. Основным преимуществом данной модели на крупных животных по сравнению с другими существующими моделями на животных и грызунах является то, что в нашей модели мы можем изучать течение болезни в течение длительного периода времени у одной и той же особи посредством повторного забора проб.

Хотя данный метод позволяет получить представление о взаимодействии хозяина и патогена in vivo, его также можно применять к другим системам, таким как альтернативные патогены или виды хозяев. Поддержание анестезии и помощь при отборе проб продемонстрирует Фишер, ветеринар нашей лаборатории. Перед началом процедуры наполните три шприца инокулятом в объеме одного, двух и пяти миллилитров.

После подтверждения действия анестезии вытяните язык животного и растяните шею. Затем, совершая легкие вращательные движения, введите металлический расширитель в пасть животного. Под визуальным контролем продвигайте расширитель вперед, используя фонарик для определения момента, когда гортань станет видна.

Затем вставьте тефлоновую трубку в рабочий канал эндоскопа. Трубка не должна выступать за кончик эндоскопа. Введите эндоскоп через зеркало.

Для обеспечения доступа эндоскопа может потребоваться небольшая регулировка зеркала. Чтобы пройти через гортань, используйте трахеобронх, который отходит в правую сторону легкого, чтобы помочь центрировать изображение на мониторе. Затем прикрепите шприц, содержащий 5 mL инокулята, к концу тефлоновой трубки.

Введите трубку в ветви, где будет размещен инокулят, и введите соответствующее количество инокулята. Затем прикрепите к трубке шприц, содержащий 1 mL инокулята. Переведите трубку в трахеобронхи и введите инокулят в соответствующую ветвь.

Извлеките эндоскоп и зеркало. Затем закрепите последний шприц в актуаторе и распылите по 1 мл инокулята в каждую ноздрю. Поместите животное обратно в клетку в положении на животе до пробуждения.

В помещении для восстановления должна быть установлена система кондиционирования воздуха, так как при общем наркозе способность животных к терморегуляции снижается. Чтобы собрать образцы смывов в нужный момент времени, прогрейте в водяной бане при температуре 38 °C пять шприцев, содержащих по 20 мл стерильного изотонического физиологического раствора. Затем введите катетер для промывания в рабочий канал эндоскопа и вставьте эндоскоп в металлический расширитель.

Затем продвигайтесь вперед в главный бронх левого легкого до достижения клиновидного положения, когда эндоскоп больше нельзя будет перемещать вперед. После этого последовательно подсоедините к лаважному катетеру шприцы с теплым раствором хлорида натрия для введения и непосредственной аспирации жидкости.

Сразу после получения поместите жидкость для бронхоальвеолярного лаважа в силиконизированные стеклянные флаконы и храните на льду, чтобы предотвратить прикрепление альвеолярных макрофагов к поверхности стекла. Зафиксируйте объем введенного физиологического раствора и объем полученного промывного материала. Затем извлеките катетер для лаважа из рабочего канала для сбора эпителиальных клеток.

Затем переместите эндоскоп к нужному месту забора проб. Например, в данном эксперименте — к бифуркации трахеи. Когда эндоскоп будет на месте, накройте бронхиальную щетку трубкой и введите её в рабочий канал эндоскопа до тех пор, пока кончик щетки не появится на мониторе. Протолкните щетку и пластиковую трубку вперед примерно на пять сантиметров.

Затем нажмите на ручку щетки, чтобы извлечь ее из пластиковой трубки. Когда щетка окажется в рабочем положении, направьте ее к области, которую необходимо очистить. Затем осторожно перемещайте щетку вперед-назад, одновременно управляя эндоскопом.

Для обеспечения контакта щетки со стенкой бронха необходимо произвести соскоб эпителиальных клеток. Прекратите соскоб при появлении крови. Затем накройте щетку колпачком и извлеките ее из рабочего канала.

Осторожно прокатите щетинки, покрытые эпителиальными клетками, по пяти предметным стеклам и зафиксируйте мазки в холодном метаноле в течение 10 минут. После высушивания стекол на воздухе храните их при температуре минус 20 °C до проведения трансбронхиальной биопсии легкого. Затем введите эндоскоп в нужное место забора проб.

Например, при использовании LOA crans, как в данном эксперименте, перед введением биопсийных щипцов в рабочий канал откройте и закройте их несколько раз, чтобы убедиться в их исправности, а затем продвиньте щипцы в боковую ветвь бронха трахеи до появления легкого сопротивления. Теперь оттяните их на два-три сантиметра назад и раскройте щипцы. Снова продвиньте щипцы вперед примерно на два сантиметра, а затем закройте их.

Вытяните и извлеките щипцы из рабочего канала. С помощью иглы осторожно удалите ткань из биопсийных щипцов и поместите ее в подходящий фиксирующий раствор для предотвращения аутолитических процессов. Наконец, после того как теленок восстановится в стойле, в течение следующих 24 часов повторно наблюдайте за животным на предмет возникновения пневмоторакса, обеспечивая его кормом и свежей водой.

После того как животное полностью придет в сознание, замороженные срезы трансбронхиальной биопсии легких можно подвергнуть иммуногистохимическому окрашиванию. Для визуализации инокулированного патогена обратите внимание на коричневые хламидийные включения в легких этого животного, которому за четыре дня до забора проб была введена хламидия C. Иммуногистохимическое окрашивание клеток лаважа позволяет визуализировать внутриклеточные патогены.

Например, на данном изображении представлены хламидийные включения в альвеолярных макрофагах, отобранных у теленка. CTAC может наблюдаться через девять дней после внутрибронхиального заражения хламидиями. Клетки бронхоальвеолярного лаважа можно дифференцировать с помощью цитологического окрашивания.

Альвеолярные макрофаги являются преобладающим типом клеток в промывных жидкостях. Однако при наличии воспалительных процессов увеличивается число нейтрофильных гранулоцитов. После освоения методики инокуляция может быть выполнена за 10–15 минут, а отбор проб — за 20–30 минут при условии правильного проведения процедуры.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить внутрибронхиальную инокуляцию телят, а также о том, как осуществлять забор бронхоальвеолярного лаважного раствора, бронхиального брашинга и трансбронхиальной биопсии легких у животного под наркозом.