Демонстрация протеолитических Активация эпителиальных натрия Channel (ENaC) путем объединения текущих измерений с детектором расщепления фрагментов

Общая цель следующего эксперимента — исследовать влияние протеаз на эпителиальный натриевый канал (ENaC), гетерологично экспрессированный в ооцитах Xenopus laevis. Это достигается путем первоначального измерения амарило чувствительного тока всей клетки в ооците. После того как ооцит восстановится, его подвергают воздействию протеазы и снова измеряют ток.

Затем параллельно ооциты подвергают биотинилированию и вестерн-блоттингу для мониторинга появления фрагментов расщепления gamma ENaC на поверхности клеток; полученные результаты демонстрируют причинно-следственную связь между расщеплением канала и его активацией, основанную на сочетании метода двухэлектродного фиксации потенциала и метода биотинилирования. Основным преимуществом этого метода перед существующими способами, такими как незапланированное измерение, является то, что ооцит может быть подвергнут воздействию протеазы или других фармакологических агентов между двумя измерениями в течение различного времени в малом объеме тестового раствора. Через два дня после выделения ооцитов *Xenopus laevis* и инъекции cRNA согласно текстовому протоколу используйте раствор ND 96 для заполнения одного шприца системы гравитационной перфузии и раствор ND 96, содержащий амид, для заполнения второго шприца.

После установки шприцев на высоту 50 сантиметров над камерой для ванночки включите 150-ваттный галогенный источник холодного света и расположите его на расстоянии 10 сантиметров над камерой с ооцитами для обеспечения хорошей визуализации с помощью бинокулярного микроскопа; включите отсос и поместите трубку отсоса напротив адаптера трубки для суперфузии в камере с ооцитами. Затем, используя устройство управления гравитационным потоком IV, настройте скорость суперфузии каждого раствора на уровень от трех до пяти миллилитров в минуту. После этого с помощью адаптера подключите трубки для суперфузии к камере с ооцитами, используя стеклянные капилляры, вытянутые на микропипетке, чтобы получить диаметр наконечника менее одного микрометра.

Затем заполните их примерно на одну четверть трехмолярным раствором хлорида калия. Вставьте капилляры в держатели тока и напряжения, а затем с помощью микроманипуляторов поместите их в ND 96, содержащий двухмолярный раствор амида. Для измерения токов всего This-клетки, чувствительных к амиду, начните с настройки кнопки смещения VM для обнуления потенциала электрода напряжения и кнопки смещения VE для обнуления токового электрода.

Поместите участок UO в ванночку в непосредственной близости от электрода измерения напряжения. Затем с помощью обоих микроэлектродов аккуратно проколите участок UO, установите удерживающий потенциал амплификатора на -60 mV и включите регистрирующее устройство. После этого подайте раствор, содержащий амид.

Далее начните запись и при необходимости отрегулируйте усиление. После того как измеренный ток достигнет стабильного плато, переключитесь на раствор без амида. Когда будет достигнуто плато тока, верните перфузию на раствор, содержащий амид. Затем, когда ток в месте UO достигнет начального базового уровня, выключите зажим напряжения и осторожно извлеките электроды, чтобы обеспечить повторное закрытие плазматической мембраны в местах прокола.

Поместите сайт Uoc в одну лунку 96-луночного планшета, содержащую от 100 до 150 µL раствора ND 96 без протеазы, на пять минут, после чего перенесите сайт UOC в раствор, содержащий протеазу, или в контрольный раствор без протеазы. В течение 30 минут после инкубации повторите текущее измерение, удалите дефектные ооциты под стереомикроскопом и подготовьте anti 96 с соответствующей протеазой и без нее. Подготовьте пастеризованные пипетки, промаркировав их и коротко опалив кончики пламенем, чтобы избежать повреждения ооцитов.

Заполните каждую лунку планшета на 6 лунок 2,5 миллилитрами ND 96 комнатной температуры или ND 96, содержащего протеазу. Затем добавьте по 30 ооцитов в каждую лунку и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре. После добавления 2,5 миллилитров ND 96 в лунки нового планшета на 6 лунок перенесите каждую группу ооцитов в лунку, заполненную ND 96.

Последовательно переносите ооциты в две дополнительные лунки с ND 96, чтобы смыть остатки протеазы, и инкубируйте их в последней лунке в течение пяти минут; приготовьте биотин в буфере для элюции биотина согласно текстовому протоколу. Поместив каждую группу ооцитов в лунку, содержащую 2,5 milliliters буфера для элюции биотина, инкубируйте их в течение 15 минут при осторожном перемешивании. Затем, поместив каждую группу ооцитов в лунку, содержащую 2,5 milliliters гасящего буфера (quench buffer) для остановки реакции биотина, перенесите их во вторую лунку с гасящим буфером и инкубируйте в течение пяти минут.

При осторожном перемешивании перенесите каждую группу ооцитов в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и, используя 1 мл лизирующего буфера с добавлением ингибиторов протеаз, лизируйте клетки, пропустив их через иглу 27-го калибра. Центрифугируйте лизаты в течение 10 минут при 1500 ×g. Перенесите супернатант в новую пробирку объемом 1,5 мл, содержащую TRITTON X 100 и MP 40, и инкубируйте пробирки на льду в течение 20 минут. После уравновешивания 100 мкл Vagaro-бидов на группу ооцитов неоднократно перемешайте пробирки на вортексе для растворения белков, добавьте биды в растворы белков с детергентом и инкубируйте образцы при перемешивании с вращением при 4 °C в течение ночи.

На следующий день центрифугируйте образцы в течение трех минут при 1500 ×g. Затем перенесите супернатант в новую пробирку для детектирования фрагментов расщепления act на поверхности клеток. Подготовьте образцы для гель-электрофореза, промыв гранулы лизис-буфером три раза перед добавлением 2X буфера для образцов SDS-PAGE. После центрифугирования образцов в течение трех минут при 20 000 ×g перенесите супернатант пипеткой в новые микроцентрифужные пробирки.

Проанализируйте образцы методом вестерн-блоттинга в соответствии с текстовым протоколом, чтобы выяснить, может ли сериновая протеаза плазмин активировать токи, опосредованные ENaC. Величина delta IE отдельных цитов, экспрессирующих ENaC, определялась до и после 30-минутной инкубации цитов в растворе, не содержащем протеаз, или в растворе с плазмином. С использованием метода двухэлектродного фиксации потенциала, показанного здесь, было установлено, что воздействие плазмина увеличивало delta IE в каждом измеренном ците.

Напротив, инкубация в растворе, не содержащем протеаз, оказала незначительный эффект. На этом рисунке сравнивается влияние химотрипсина на ENaC дикого типа и на ENaC с мутировавшими сайтами расщепления протестазином и плазмином. Как видно здесь, мутантный канал замедляет и снижает активацию тока, опосредованного ENaC, под действием химотрипсина.

Кроме того, он генерирует фрагмент расщепления с меньшей скоростью по сравнению с ENaC дикого типа. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как комбинация описанных методов может быть использована для установления корреляции между стимулирующим эффектом протеаз на внутреннее появление и возникновением продуктов расщепления на поверхности клетки. Это может быть полезно для широкого спектра применений, например, для решения аналогичных вопросов, касающихся регуляции других ионных каналов, транспортеров или трансмембранных рецепторов.