Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель данной процедуры заключается в получении прогениторных клеток нервного гребня из плюрипотентных стволовых клеток человека с помощью короткого, воспроизводимого и определенного протокола. Эти клетки могут быть использованы как для изучения заболеваний, связанных с нервным гребнем, in vitro, так и для дальнейшей дифференцировки этих клеток в клетки-потомки. Это достигается путем первоначального посева высокой плотности плюрипотентных стволовых клеток человека монослоем на матригель.

На втором этапе проводится дифференцировка клеток в нейроэпителиальные клетки с использованием определенной последовательности и комбинации малых молекул, воздействующих на ключевые сигнальные пути. Затем нейроэпителиальные клетки пересаживают на новый слой и подвергают дальнейшей дифференцировке в клетки-предшественники нервного гребня. Заключительным этапом является выделение клеток нервного гребня с помощью метода сортировки клеток с флуоресцентной активацией.

В конечном итоге для подтверждения получения соответствующих клеток нервного гребня используются иммунофлуоресцентный анализ и функциональные тесты, такие как оценка миграционной способности клеток. Основным преимуществом данного метода перед существующими протоколами получения клеток нервного гребня из плюрипотентных стволовых клеток человека является его меньшая продолжительность, которая составляет всего 18 дней.

Данный метод обладает более высокой воспроизводимостью благодаря отсутствию необходимости в использовании фидерных клеток MS5. Его легко масштабировать, и он демонстрирует высокую воспроизводимость для различных линий плюрипотентных стволовых клеток человека. Применение этой методики открывает возможности для изучения механизмов заболеваний человека, связанных с нейрональным путем развития, и обладает потенциалом для совершенствования детального моделирования этих заболеваний in vitro и скрининга лекарственных препаратов.

Перед началом данного протокола убедитесь, что колонии плюрипотентных стволовых клеток человека достаточно велики, чтобы их можно было видеть невооруженным глазом, и имеют четкие края с минимальным количеством дифференцированных клеток по периферии. Когда hPSC будут готовы к пассированию, аспирируйте среду, один раз промойте клетки пятью миллилитрами 1×PBS и добавьте к клеткам четыре миллилитра 0,05% трипсина в EDTA. Затем интенсивно встряхивайте чашку в горизонтальном направлении в течение двух минут, пока под микроскопом не станет видно, что эмбриональные фибробласты мыши отделяются от поверхности планшета в виде одиночных клеток.

Колонии HPSC останутся прикрепленными к чашке; затем немедленно и полностью аспирируйте трипсин и оставьте планшет при комнатной температуре на две-четыре минуты. Добавьте в планшет два миллилитра среды HES и с помощью пипетки P 1000 отсоедините клетки. Если клетки не отделяются легко, инкубируйте планшет еще две-три минуты.

При комнатной температуре перенесите суспензию клеток в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 8 мл среды HES с добавлением 10 мкМ дигидрохлорида Y 2 7 6 3 2. Затем аспирируйте Matrigel из предварительно обработанной чашки диаметром 10 см и высейте клетки на обработанную Matrigel чашку в соотношении 1:1 или 1:2. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2.

Ежедневно подкармливайте клетки средой HES до тех пор, пока они не будут готовы к дифференцировке. Затем начните нейральную дифференцировку, когда клетки достигнут 90%–100% конфлюэнтности. Этот день считается нулевым.

Ежедневно с нулевого по третий день подкармливайте клетки 10 мл дифференцировочной среды KSR, содержащей 0,1 µM LDN 193189 и 10 µM SB 431542. Затем в четвертый и пятый дни подкармливайте клетки 10 мл среды, состоящей из 75% дифференцировочной среды KSR и 25% дифференцировочной среды 2, с добавлением 0,1 µM LDN 193189 и 10 µM SB 431542. В шестой и седьмой дни подкармливайте клетки средой, доведенной до соотношения 50% дифференцировочной среды KSR и 50% дифференцировочной среды 2, с дополнительным содержимым 0,1 µM LDN 193189 и 10 µM SB 431542.

На восьмой и девятый дни подкормите клетки средой для дифференцировки, состоящей из 25% KSR и 75% N2, содержащей 0,1 мкМ LDN 193189 и 10 мкМ SB 431542. Затем, на девятый и десятый дни, подготовьте культуральные чашки с поли-L-орнитином, ламинином 1 и фибронектином согласно текстовому протоколу; они будут использоваться для пересадки клеток. На 11-й день подкормите клетки дифференцировочной средой N2, дополненной 0,1 мкМ LDN 193189 и 10 мкМ SB 431542. На 10-й или 11-й день аспирируйте раствор ламинина 1 и фибронектина из предварительно подготовленных культуральных чашек и дайте им высохнуть при комнатной температуре в ламинарном шкафу для культур тканей в течение 20–30 минут.

Затем удалите среду из дифференцирующих клеток и один раз промойте клетки с помощью XPBS. После этого добавьте по восемь миллилитров Accutane на каждую 10-сантиметровую чашку и инкубируйте чашки в течение 20 минут при 37 °C. После инкубации используйте скребок для клеток, чтобы отделить их, а затем ресуспендируйте клетки в растворе Accutane.

С помощью пятимиллилитровой пипетки перенесите суспензию клеток в коническую пробирку объемом 15 мл. Затем добавьте в пробирку пять миллилитров 1X PBS и центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 115 ×g. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 10 мл 1X PBS. После этого профильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 40 мкм, чтобы получить суспензию одиночных клеток.

Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Снова центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 115 Gs и ресуспендируйте их до концентрации от 100 000 до 150 000 клеток на 10 µL дополненной среды для дифференцировки N2. С помощью репипетора нанесите капли клеточной суспензии объемом 10 µL на чашки для культивирования диаметром 15 см, предварительно обработанные поли-L-орнином.

Ламинин 1 и фибронектин. Оставьте капли при комнатной температуре на 15–20 минут. Затем очень осторожно добавьте в планшет 30 мл дополненной дифференцировочной среды N2, не нарушая целостности капель.

Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2. На 12-й день аккуратно добавьте клеткам 20 мл среды для дифференцировки N2, содержащей 200 µM ретиноевой кислоты, 20 ng/ml мозгового нейротрофического фактора, 100 ng/mL фактора роста фибробластов 8 и 20 ng/mL белка sonic hedgehog на одну чашку диаметром 15 см.

Затем с 14-го по 17-й день каждые два-три дня подкармливайте клетки средой для дифференцировки N2, содержащей только 200 µM ретиноевой кислоты, 20 ng/ml нейротрофического фактора мозга и 100 ng/mL фактора роста фибробластов 8. На 16-й и 17-й дни подготовьте планшеты с поли-L-лизином, ламинином-1 и фибронектином для повторного посева клеток нервного гребня.

После проведения FACS-анализа на 18-й день, когда клетки были отсортированы методом флуоресцентной сортировки клеток, подсчитайте количество клеток нервного гребня, а затем центрифугируйте их при 115 G в течение пяти минут. Ресуспендируйте осадок клеток в среде для дифференцировки N2, дополненной 10 ng/mL.

FGF2 в концентрации 20 ng/mL, EGF и 10 µM Y 27632 дигидрохлорида при плотности 30 000 клеток на 10 µL. Тщательно высушите чашки для культивирования, предварительно обработанные поли-L-лизином, ламинином 1 и фибронектином. Затем нанесите примерно от 50 до 70 капель клеточной суспензии на чашку диаметром 10 cm.

Инкубируйте клетки при комнатной температуре от 15 до 20 минут, добавив по 20 миллилитров среды для дифференцировки N2, дополненной 10 нанограммами на миллилитр FGF2, 20 нанограммами на миллилитр EGF и 10 микромолярным Y 27632 дигидрохлоридом в каждую чашку диаметром 10 сантиметров, не затрагивая капли.

Затем инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% carbon dioxide. После инкубации поддерживайте и пассируйте клетки нейрального гребня; согласно прилагаемому текстовому протоколу, клетки нейрального гребня были получены из плюрипотентных стволовых клеток человека за 18 дней с использованием данного нового протокола дифференцировки in vitro без использования фидерного слоя.

Анализ методом FACS на 18-й день позволил выявить клетки, положительные по маркерам HNK-1 и P75, что подтвердило наличие клеток нервного гребня. Как в протоколе дифференцировки без использования фидерного слоя, так и в протоколе с использованием фидерных клеток, клетки нервного гребня проходили стадию нейральных розеток. Кроме того, клетки, отсортированные методом FACS, обладали идентичной морфологией и экспрессировали маркеры нервного гребня HNK-1 и P75. Сравнение глобальной экспрессии генов в клетках нервного гребня, полученных с помощью этих двух протоколов дифференцировки, показало, что обе группы клеток образуют близко расположенные кластеры.

Анализ миграционной способности клеток нервного гребня, полученных с использованием протокола без фидерного слоя, показал, что через 48 часов клетки успешно мигрировали в зону повреждения (царапину). Эти клетки также обладают потенциалом к дифференцировке в клетки автономной нервной системы, что было подтверждено положительным окрашиванием на Mash1 и Tuj1 после дополнительных четырех дней дифференцировки. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить нейрализацию человеческих плюрипотентных стволовых клеток и получать клетки-предшественники нервного гребня in vitro.