Автоматическое измерение микроциркуляции крови скорость потока в легочных метастазов у ​​крыс

Общая цель этой процедуры заключается в создании грудного окна для внутрижизненной микроскопии у крысы, несущей легочные метастазы. Это достигается путем первой анестезии животного, несущего метастазы, его интубации и подключения к аппарату искусственной вентиляции легких для небольших животных для герметичной вентиляции. Затем флуоресцентно меченные эритроциты вводятся в хвостовую вену животного.

Затем осуществляется хирургический доступ к грудной полости без повреждения поверхности легких, выявляются метастазы и вставляется окно. Наконец, проводится микроскопическая визуализация животного. В конечном счете, хирургическое вскрытие легкого и установка окна для острой микроскопии у живой крысы позволяют автоматически измерять микроциркуляторный кровоток при метастазах в легких.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микрокомпьютерная томография грудной клетки, неинвазивная эпиторакальная микроскопия и микропэт раковых легких, заключается в том, что он позволяет проводить измерения микроциркуляции легочных метастазов в легких в режиме реального времени с высоким временным и пространственным разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазов в легкие, например, как лечение или прогрессирование рака могут изменить кровоток и, в конечном итоге, гипоксию при метастазах в легкие. Применение этого метода распространяется на диагностику и терапию метастатического рака легких, поскольку он позволяет получить беспрецедентное представление о динамике микроциркуляции и метаболического микроокружения этих метастатических опухолей.

Этот метод откроет дверь к пониманию динамики легочных метастазов, микроциркуляции и, таким образом, поможет улучшить современные стратегии лечения. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что требуется опыт для настройки таким образом, чтобы свести к минимуму автономное движение легких. После индуцирования и подтверждения метастатического рака у крысы согласно текстовому протоколу и обезболивания внутрибрюшинной дозой пентобарбитала, выполните щипкование пальцев ног для подтверждения седации.

Выбрейте животное на той стороне тела, которая имеет метастатическое заболевание, и в области шеи, и сотрите все оставшиеся выпавшие волосы с кожи, чтобы они не мешали визуализации. Наносите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить их пересыхание. Положите животное в лежачее положение на металлическую пластину, которая находится на грелке с циркуляцией воды при температуре 37 градусов Цельсия и с помощью ленты прикрепите передние и задние конечности.

Прикрепите пульсоксиметр для контроля и записи жизненно важных показателей на протяжении всей процедуры для интубации крысы. Начните с того, что сделайте поперечный разрез кожи шейки матки. Затем отделите медиально продольную мускулатуру вентрально к трахее с помощью острых щипцов.

Используйте повторяющееся действие от открытия до закрытия, чтобы создать проход для шва через дорсальную сторону трахеи на вентральной стороне между вторым и третьим кольцами трахеи. Сделайте небольшой надрез в трахее. Оставьте достаточно длинную часть трахеи открытой на тыльной поверхности, чтобы обеспечить фиксацию катетера.

Затем вставьте канюлю Y-трахеи диаметром от 2,5 до 3,0 мм в трахею и используйте шов из четырех нулевых мононитей для затяжки. Чтобы поддерживать положительное легочное давление, подключите канюлю к 100% кислороду через аппарат искусственной вентиляции легких с циклическим действием давления с бутылкой, подключенной к выдоховому каналу, который заполнен шестью сантиметрами воды. Затем с помощью иглы 25-27 калибра и шприца, наполненного гепаринизированным физиологическим раствором, ввести катетер в одну из хвостовых вен и с помощью ленты зафиксировать его на месте с помощью эритроцитов, предварительно собранных и помеченных DII в соответствии с текстовым протоколом, ввести 300 микролитров в хвостовую вену крысы для создания легочного окна.

Сделайте разрез на раковой стороне грудной клетки и отделите кожу с помощью тупой диссекции. Рассеките два слоя перекрывающейся мускулатуры и оставьте нетронутыми межреберные мышцы в области шестого и седьмого ребер. Создать перфорацию в грудной полости примерно 1,5 сантиметра в диаметре для выполнения остеотомии.

Начните регулировать давление вдоха на аппарате искусственной вентиляции легких таким образом, чтобы свести к минимуму механическое взаимодействие между поверхностью легких и грудной клеткой. Удалите части шестого и седьмого ребер с помощью зубчатых хирургических щипцов, чтобы плотно удерживать ребро, которое нужно резать, и хирургических ножниц. Разрежьте медиальную сторону ребра под углом примерно 45 градусов острой стороной, направленной наружу.

Разрежьте боковую сторону кости аналогичным образом, опять же, оставив заостренную сторону наружу. Чтобы избежать повреждения легкого, повторите остеотомию с соседним ребром перед разрезанием межреберных мышц и удалите иссеченный кусок. Создайте длинное окно, изготовленное на заказ, используя клей или небольшое количество вакуумной смазки, чтобы прикрепить защитное стекло к гнезду из плексигласа.

Затем вставьте окно так, чтобы поверхностные метастазы располагались близко к центру окна, при необходимости увеличив отверстие с одной стороны. После вставки лунки в перфорацию и создания прямого контакта с висцеральной плеврой легкого, используйте четыре швов нулевой мононити, чтобы пришить края оконной рамы к окружающей межреберной мышце. Увеличьте давление вдоха на вентиляторе, чтобы обеспечить выход остаточного воздуха и герметичность.

Затем поместите животное в специально изготовленный ограничитель, предназначенный для устранения движения в направлении Z, и расположите его на нагретой стальной пластине под флуоресцентным микроскопом. Затем вставляют ректальный термистор для контроля температуры тела животного. Отрегулируйте винты удерживающего устройства для животных и давление на вентиляторе для достижения оптимального контроля бокового движения.

Для визуализации и измерения микроциркуляционного кровотока. Используйте ПЗС-камеру с отрицательной температурой охлаждения чипа 40 градусов Цельсия и объективом с 10-кратным увеличением. С помощью стандартных наборов фильтров стержня Domine Trit C записывайте фактическую частоту кадров и разрешение пикселей результирующих последовательностей изображений.

Записывайте не менее 200 изображений на одну стопку, чтобы обеспечить успешный анализ скорости потока во время сеанса визуализации для восполнения потери жидкости у животного. Для поддержания постоянной скорости кровотока. Выполняйте внутрибрюшинную инъекцию примерно одного миллилитра физиологического раствора каждый час.

Усыпьте животное в соответствии с текстовым протоколом после завершения визуализации. Известно, что сосудистая сеть при солидных опухолях значительно отличается от нормального кровоснабжения, демонстрируя большую степень извитости и более высокие межсосудистые расстояния. Соответственно, как показано здесь, траектории кровотока при экспериментальном легочном раке молочной железы и метастазах имеют неправильную форму и большие межсосудистые промежутки по сравнению с нормальной микроциркуляцией.

В этом исследовании, аналогично тому, что было продемонстрировано в здоровых легких при дозировании комбинации эфедрина и антагониста рецепторов эндотелина, энтин увеличивал скорость кровотока при саркоме мышей. Каждая точка данных представляет собой объединенные индивидуальные средние значения трех измерений с пятиминутными интервалами, усредненные по данным, полученным у пяти животных. Первая инъекция значительно увеличивала скорость кровотока в области опухоли с 0,61 плюс-минус 0,12 миллиметра в секунду до 0,74, плюс-минус 0,19.

В то время как второй впрыск поддерживал повышенную скорость потока на уровне 0,74 плюс-минус 0,19 миллиметра в секунду. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что при разрезании грудной клетки следует избегать выступающей остроконечной структуры, потому что это приведет к последующей травме и кровотечению из легкого после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области исследования легочных метастазов к изучению конечных точек, связанных с разработкой противораковых препаратов, таких как диффузия, ограничение доставки цитотоксических препаратов, диффузия, ограниченная гипоксия и модели метастазов в легких на крысах.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить хирургический доступ к метастазирующему или здоровому легкому крысы и провести микроскопическую визуализацию на нем.