Имплантация нижней полой вены вмешательство трансплантат в мышиной модели

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании клеточных и молекулярных механизмов формирования новых тканей и развития стеноза в тканеинженерных сосудистых трансплантатах. Первые биоразлагаемые трубчатые каркасы собираются путем покрытия нетканой войлочной сетки полигликолевой кислотой с сополимером лактона эпсилона и L-лактида. Следующими шагами являются забор костного мозга и изоляция мононуклеарных клеток с помощью центрифугирования с градиентом плотности.

Затем примерно 1 миллион клеток засевают на каркас и инкубируют в течение ночи. Последним шагом является имплантация засеянного каркаса в качестве промежуточного трансплантата нижней полой вены. В конечном счете, результаты могут показать инфильтрацию клеток и отложение внеклеточного матрикса в тканеинженерном сосудистом трансплантате с помощью иммуногистохимии.

Последствия этого метода заключаются в том, чтобы лучше понять, что вызывает образование стеноза и тканеинженерных сосудистых трансплантатов, а затем использовать эту информацию для разработки лучшего тканеинженерного сосудистого трансплантата. Из нашего клинического исследования мы узнали, что почти у четверти пациентов, получивших тканевый кондуит, развилось сужение. Наша цель – устранить эту проблему.

Хотя этот метод может быть применен при врожденном пороке сердца, он также может быть применен к операции шунтирования толстой кишки или конду для изменения венозного признака. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывали трудности из-за тонких микрохирургических методов, необходимых во время осмоса вены. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы искали лучший способ охарактеризовать образование новой ткани и способы предотвращения развития стеноза в тканеинженерных сосудистых трансплантатах, используемых в нашем клиническом исследовании на людях.

Сначала начните смешивать эпсилонный колпачковый лактон и сополимер L-лактида. Для полного растворения требуется от 60 до 90 минут. Тем временем возьмите лист полигликолевой кислоты из морозилки и вырежьте из него несколько отрезков размером пять на восемь миллиметров.

Затем отрежьте фильтр от наконечника пипетки объемом 10 микролитров и вставьте иглу 19 калибра в его дистальный конец. С помощью щипцов оберните вокруг иглы кусочек войлока полигликолевой кислоты. Затем с помощью затупленной иглы 18 калибра осторожно вставьте войлок в дистальный конец наконечника пипетки вокруг иглы 19 калибра.

Когда раствор сополимера будет готов, загрузите 40 микролитров в верхнюю часть наконечника пипетки, чтобы пропитать раствором войлок полигликолевой кислоты. Выдавите пузырьки воздуха с помощью пипетки, пока не будут удалены все пузырьки воздуха. Переложите все подготовленные графты в 50-миллилитровую пробирку головками игл вниз и поставьте их при температуре минус 80 градусов Цельсия на 20 минут.

Затем лиофилизируют графты под вакуумом в течение 24 часов. Открыв крышку трубок, на следующий день изолируйте графты от игл. Обрежьте оба конца привоя на чистый срез в четыре-пять миллиметров.

Затем наденьте эти трансплантаты обратно на иглы, чтобы они сохранили свою форму. Хранят привой в десквите и накануне вечером рассаживают с ячейками. Храните их под ультрафиолетовым светом в биозащитном капюшоне от усыпленной мыши.

Соберите все бедренные и большеберцовые кости в чашку с 10 миллилитрами РПМИ, отрежьте оба конца от каждой кости. А во второй чашке промойте костный мозг, введя RPMI из иглы 25 калибра через все кости. Используйте в общей сложности три миллилитра оборотов в минуту.

Я собираю весь костный мозг в RPMI в одну 15-миллилитровую пробирку и промываю посуду еще двумя миллилитрами RPMI, чтобы получить общий объем в пять миллилитров. Подсчитайте ячейки в этой коллекции. Далее загрузите пять миллилитров фиала в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, и медленно заполните ее пятью миллилитрами костного мозга.

Затем с помощью RPMI вращайте трубку в течение 30 минут при температуре 528 G с отрывом и при температуре 24 градуса Цельсия. Соберите средний слой из пробирки, в которой находятся мононуклеарные клетки. Разбавьте этот слой один к одному в PBS.

Уменьшите клеточный раствор и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах PBS. Затем повторите спин. Разведите клеточную гранулу примерно в 200 микролитрах RPMI и пересчитайте клетки дважды.

Используйте среднее значение, чтобы сконцентрировать их до 1 миллиона клеток на 10 микролитров RPMI для трансплантата. Используйте шести-восьминедельную суку C 57 black six. Взвесьте мышь и нанесите кетопрофен в качестве обезболивающего средства перед анестезией.

Затем обезболите его инъекцией в нижний квадрант. После подтверждения анестезии щипцом ноги подстригите волосы на животе, смажьте глаза и расположите мышь для операции на подушечке, обернутой стерильным полотенцем с полиэтиленовой подкладкой. Протрите операционную область тремя чередующимися скрабами бетадина и спирта.

Затем накидывайте мышь, оставляя открытым только брюшную полость. Начните операцию с лапаротомии по средней линии. Сделайте разрез снизу от мечевидной кости к надлобковой области.

Далее вытесните и оберните кишки марлей, смоченной в физрастворе. Затем выполняют тупое рассечение прозрачных тканей из подкожной аорты и сосудистой полой вены. Зажмите дистальные стороны и проксимальные стороны аорты и полой вены.

После тупого зажима разделите два сосуда. Теперь приступайте к имплантации. Теперь пересеките полую вену и, при необходимости, перевяжите ветви брюшной аорты мононитью 10 узлов.

Наложение швов на конические иглы перед разрезом на протяжении всей имплантации. Часто промывайте трансплантат раствором гепарина для профилактики тромбоза. Первые два шва с обеих сторон трансплантата являются наиболее важными этапами всего процесса.

Когда они размещены неаккуратно, трудно разделить передний и задний слои НПВ. Если слои четко не идентифицированы, вероятность случайного сшивания их вместе выше. Обрежьте лишний материал прививки и закрепите прививку стежками с обоих концов.

Добавьте четыре или пять стежков с помощью 10 т. Наложите шов вдоль лицевой стороны графта. Переверните его и проделайте то же самое вдоль тыльной стороны после завершения имплантации.

Снимите проксимальный зажим и контролируйте кровотечение с помощью рассасывающегося средства для гемостата. Когда кровотечение полностью закончится, снимите дистальный зажим и повторите контроль кровотечения. Убедитесь, что кровь течет через трансплантат до того, как животное поднимется вверх.

Использование шести черных полиакриламидных монофиламентных швов. Закройте кожу в два слоя. Теперь введите полмиллилитра физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание.

Затем переложите мышь в клетку для восстановления с теплой подушкой При амбулаторном пересадке перенесите мышь в ее домашнюю клетку и введите ибупрофен на 48 часов. СЭМ лесов показывает, что внутренний диаметр составляет около одного миллиметра, а толщина стенки — около 0,17 миллиметра. Пористость каркаса составила 78,5% при среднем размере пор 45 мкм.

Сразу после имплантации тканеинженерный сосудистый трансплантат рассматривался под микроскопом. Через две недели его посмотрели снова. Он до сих пор держит свою форму.

Понятно, что трансплантат деградировал и постепенно заменялся новой тканью. В течение двух недель посев клеток фактически улучшил проходимость трансплантата на 25%, трансплантат был удален для гистологического анализа. Окрашивание H и D обнажило ткань neo по всему каркасу, пятно с сердечками и массонами.

Трирема показала эластин в интимальных слоях и показал коллаген в медиальных слоях. Окрашивание CD 31 выявило выстилку эндотелиальных клеток в инальном слое. Окрашивание Alpha SMA показало, что трансплантат также был заполнен сливающимися гладкими мышцами.

Даже инфильтрация макрофагов была очевидна, что видно по окрашиванию F 4 80. В заключение этого видео вы должны иметь лучшее представление о том, как изготовить небольшой тканевый сосудистый трансплантат, включая методы изготовления маломасштабного биоразлагаемого каркаса для выделения мононуклеарных клеток, полученных из костного мозга, и их посева на каркас. И, наконец, мы должны продемонстрировать вам методы использования микрохирургических методик для имплантации тканеинженерного сосудистого трансплантата в зеркальной модели.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 30-45 минут. Другие методы, такие как интерпретация аортального трансплантата, могут быть выполнены впоследствии, чтобы исследовать разработку тканеинженерных сосудистых трансплантатов для операции аортокоронарного шунтирования. Несмотря на то, что важно помнить о необходимости увлажнять операционную область и часто промывать трансплантат для предотвращения острого тромбоза, эти методы проложили путь исследователям в области тканевой инженерии для изучения формирования ногтевой ткани и предотвращения стеноза в тканевом сосудистом трансплантате.