Комплексный анализ транскрипции Dynamics от мозга образцов После поведенческой Опыт

Общей целью данного эксперимента является изучение транскрипционной динамики и определенных ядер мозга мышей в соответствии с поведенческим опытом. Это достигается путем предварительного приучения животных и регистрации их локомоторной активности после введения физиологического раствора. После привыкания локомоторная активность регистрируется после однократного приема кокаина, затем отбираются образцы из прилежащего ядра и используются для выделения РНК и получения CDNA.

Затем проводится анализ КПЦР с целью изучения экспрессии генов, индуцированной поведением. В конечном счете, получены результаты, которые показывают транскрипционную динамику после опыта с кокаином Демонстрировать протокол будут доктор Хату, руководитель лаборатории, Дум Муер, аспирант лаборатории, и Дюран, студент бакалавриата из лаборатории. Каждая мышь приучена к процедурам обработки и инъекции, организована в клетки до начала эксперимента таким образом, что мыши не будут перемещаться между клетками в будущем, и мыши никогда не будут оставлены в изоляции на длительный период времени.

За 30 минут до начала тестирования все испытательные клетки должны быть перенесены в поведенческую комнату, чтобы позволить животным акклиматизироваться к окружающей среде. Введите внутрибрюшинную инъекцию 250 микролитров физиологического раствора сразу после инъекции, поместите мышь в поведенческую камеру для мониторинга двигательной активности в течение 15 минут. Мышь может быть помещена в поведенческую камеру на 20 минут.

Активность, отслеживаемая со второй по 17-ю минуты. Повторяйте эти действия в одно и то же время дня в течение следующих двух дней. На четвертый день введите одну инъекцию кокаина или физиологического раствора, в зависимости от группы, и немедленно поместите мышь в камеру для наблюдения за местной двигательной активностью в течение 20 минут в выбранные моменты времени после воздействия кокаина, извлеките мозг и поместите его в ледяной раствор спинномозговой жидкости на одну-две минуты для охлаждения и затвердевания.

Удалив мозжечок и отведя лишнюю жидкость, приклейте мозг к стадии вибрама ростральной частью вверх. Заполните камеру ледяным ликвором A и разрежьте срезы 200 микрон до тех пор, пока не будет четко идентифицировано прилежащее ядро. При разрезании обратите пристальное внимание на форму мозолистого тела, расположение и форму передней спайки и желудочков.

После того, как правильная область определена, срежьте два среза по 400 микрон, из которых под стереоскопом будет расчленено прилежащее ядро. Используйте тонкое лезвие, чтобы рассечь прилежащее ядро в сторону от ломтиков. Четыре быстрых прохода лезвием в нужной области должны немедленно изолировать соответствующую ткань.

Поместите изолированную ткань в 900 микролитров лизисисного реагента и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не начнется экстракция РНК, чтобы начать размораживание пробирок при 37 градусах Цельсия и гомогенизацию. Использование иглы 25 калибра может быть трудным и потребовать прижимания ткани к стенке трубки, чтобы гомогенизировать ее на мелкие кусочки. Чтобы обеспечить надлежащую гомогенизацию, пипетируйте лизат на мини-колонку измельчителя кайя и центрифугу.

Пипеткой издайте лизат в новую микроцентрифужную пробирку и извлеките РНК в соответствии с инструкциями производителя. После очистки РНК проводят обратную транскрипцию до CDNA, а также целевую специфическую преемную амплификацию образцов праймерами, направленными против выбранной для анализа группы генов. Эти процедуры описаны в текстовой версии протокола.

Коммерческие микрофлюидные чипы для комплексного анализа QPCR доступны в форматах 48 на 48. Формат, позволяющий анализировать 48 образцов с помощью 48 наборов датчиков или в формате 96 на 96, в котором анализируются 96 образцов с помощью 96 датчиков. В большинстве случаев выбор чипа в первую очередь зависит от количества анализируемых образцов.

Сначала приготовьте образец смеси в соответствии с чипом, выбранным для эксперимента. Соблюдайте осторожность при пипетировании реагента, загружающего образцы красителя 20 XDNA. Перемешивайте растворы смеси образцов в течение не менее 20 секунд и центрифугируйте не менее 30 секунд.

Подготовленные реакции могут храниться в течение короткого времени при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока чип не будет готов к загрузке. Затем приготовьте смесь для анализа, тщательно перемешайте смесь образцов и центрифугируйте для раскрутки всех компонентов. Как было показано ранее, чип IFC с динамической матрицей имеет входные отверстия для образцов и анализов, а также указанные входы для жидкости контрольной линии, используемой для создания давления в микрофлюидных камерах.

Сначала впрыскиваем жидкость управляющей магистрали в каждый аккумулятор на чипе. Затем подготовьте микросхему, поместив ее в контроллер IFC и запустив соответствующий скрипт. Когда сценарий будет завершен, извлеките загрунтованный чип из контроллера IFC и пипетируйте по пять микролитров каждого анализа.

Перемешайте с чипсами. Добавьте пять микролитров каждой смеси образцов во входные отверстия и верните микросхему в контроллер IFC с помощью программного обеспечения контроллера IFC. Запустите скрипт для загрузки образцов и анализов в чип.

Когда скрипт смешивания нагрузки завершится, извлеките загруженную микросхему из контроллера IFC. Затем загрузите чип в термоамплификатор и создайте новый участок стружки, который включает анализ кривой плавления. Использование программного обеспечения термоамплификатора обеспечивает правильное распознавание реакционных камер и позволяет реакции протекать до конца.

Повышение двигательной активности было заметно после однократной острой инъекции кокаина. На этом корональном срезе толстыми белыми линиями обозначены места разрезов, сделанных для определения границ прилежащего ядра. Во время диссекции кривые амплификации праймеров, направленных против CFO и phos B, демонстрируют, что пары праймеров амплифицируют свой целевой транскрипт примерно со 100% эффективностью.

Результаты показывают, что в каждом цикле индуцированная кокаином экспрессия CFO и phos B в прилежащем ядре была самой высокой через один и два часа после воздействия. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование нового поколения, чтобы идентифицировать новый неохарактеризованный транскрипт.