Комплексный анализ транскрипции Dynamics от мозга образцов После поведенческой Опыт

Общая цель следующего эксперимента — изучение динамики транскрипции в определенных ядрах головного мозга мышей после поведенческого опыта. Для этого сначала животных приучают к условиям содержания и регистрируют их локомоторную активность после инъекции физиологического раствора. После привыкания регистрируют локомоторную активность после однократного введения кокаина, затем собирают образцы из прилежащего ядра, которые используются для изоляции РНК и подготовки кДНК.

Далее проводится анализ QPCR для изучения экспрессии генов, индуцированной поведением. В итоге получены результаты, демонстрирующие транскрипционную динамику после воздействия кокаина. Протокол демонстрируют руководитель лаборатории доктор Хату, аспирант лаборатории Дум Мюэр и студент бакалавриата лаборатории Дуран. В течение трех дней подряд каждая мышь проходит привыкание к процедурам манипуляций и инъекций; мышей распределяют по клеткам до начала эксперимента таким образом, чтобы в дальнейшем они не переводились из одной клетки в другую и не оставались в изоляции на длительный период времени.

За 30 минут до начала тестирования все тестовые клетки следует перенести в помещение для поведенческих исследований, чтобы животные могли акклиматизироваться к окружающей среде. Введите внутрибрюшинную инъекцию 250 microliters физиологического раствора; сразу после инъекции поместите мышь в поведенческую камеру для мониторинга локомоторной активности в течение 15 минут. Мышь можно оставить в поведенческой камере на 20 минут.

Активность регистрировали со второй по 17-ю минуту. Повторяйте эти шаги в то же время суток в течение следующих двух дней. На четвертый день введите одну инъекцию кокаина или физиологического раствора, в зависимости от группы, и немедленно поместите мышь в камеру для мониторинга локальной двигательной активности в течение 20 минут в выбранные моменты времени после воздействия кокаина, затем извлеките мозг и поместите его в ледяной раствор A CSF на одну-две минуты для охлаждения и затвердевания.

После удаления мозжечка и удаления излишков жидкости зафиксируйте мозг клеем на предметном столике вибратома ростральной частью вверх. Заполните камеру ледяной искусственной спинномозговой жидкостью (A CSF) и делайте срезы толщиной 200 микрон до четкой идентификации прилежащего ядра. В процессе резания внимательно следите за формой мозолистого тела, расположением и формой передней комиссуры и желудочков.

После определения нужной области сделайте два среза толщиной 400 микрон, из которых будет выделено прилежащее ядро под стереоскопом. С помощью тонкого лезвия отделите прилежащее ядро от срезов. Четыре быстрых движения лезвием в соответствующей области должны привести к немедленному выделению нужной ткани.

Поместите изолированную ткань в 900 µL лизирующего реагента и храните при -80 °C до начала экстракции РНК; перед началом работы разморозьте пробирки при 37 °C и проведите гомогенизацию. Первые несколько циклов гомогенизации иглой 25G могут быть затруднены, поэтому может потребоваться прижимать ткань к стенке пробирки для измельчения ее на мелкие фрагменты. Для обеспечения надлежащей гомогенизации перенесите лизат пипеткой в мини-спин-колонку Kaya Shredder и центрифугируйте.

Перенесите лизат пипеткой в новую микроцентрифужную пробирку и экстрагируйте РНК в соответствии с инструкциями производителя. После очистки РНК проводят обратную транскрипцию в кДНК, а также таргетную преамплификацию образцов с использованием праймеров к группе генов, выбранных для анализа. Эти процедуры описаны в текстовой версии протокола.

Коммерческие микрофлюидные чипы для комплексного количественного ПЦР-анализа доступны в формате 48 на 48, что позволяет анализировать 48 образцов с использованием 48 наборов зондов, либо в формате 96 на 96, в котором анализируются 96 образцов с использованием 96 зондов. В большинстве случаев выбор чипа зависит прежде всего от количества анализируемых образцов.

Сначала подготовьте смесь образцов в соответствии с чипом, выбранным для эксперимента. Соблюдайте осторожность при дозировании реагента для загрузки образцов с 20-кратным красителем для связывания ДНК. Перемешивайте растворы смесей образцов не менее 20 секунд и центрифугируйте в течение как минимум 30 секунд.

Подготовленные реакционные смеси можно хранить в течение короткого времени при температуре 4 °C до момента загрузки чипа. Затем приготовьте рабочий раствор для анализа, тщательно перемешайте смесь образцов и центрифугируйте ее для осаждения всех компонентов. Как было показано ранее, чип IFC с динамическим массивом имеет входные отверстия для образцов и реагентов, а также специальные входы для жидкости контрольной линии, используемой для создания давления в микрофлюидных камерах.

Сначала введите жидкость для линий управления в каждый аккумулятор на чипе. Затем подготовьте чип, поместив его в контроллер IFC и запустив соответствующий скрипт. После завершения работы скрипта извлеките подготовленный чип из контроллера IFC и пипетируйте по 5 µL каждого реагента для анализа.

Перемешайте смеси на чипе. Добавьте по 5 µL каждой смеси образцов в соответствующие входные отверстия и верните чип в контроллер IFC с помощью программного обеспечения контроллера IFC. Запустите скрипт для загрузки образцов и реагентов для анализа в чип.

После завершения работы скрипта смешивания образцов извлеките загруженный чип из контроллера IFC. Затем установите чип в термоциклер и создайте новый запуск, включающий анализ кривых плавления. С помощью программного обеспечения термоциклера убедитесь, что реакционные камеры определены правильно, и дождитесь полного завершения реакции.

После однократной острой инъекции кокаина наблюдалось повышение локомоторной активности. На данном корональном срезе толстыми белыми линиями отмечены места разрезов, определяющих границы прилежащего ядра. В процессе диссекции кривые амплификации праймеров к CFOs и phos B демонстрируют, что пары праймеров амплифицируют свой целевой транскрипт с эффективностью приблизительно 100%.

В каждом цикле результаты показывают, что кокаин индуцировал максимальную экспрессию CFOs и phos B в прилежащем ядре через один и два часа после воздействия. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как секвенирование следующего поколения, для идентификации новых нехарактеризованных транскриптов.