Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации грамотрицательных организмов непосредственно из бульона с использованием технологии maloff, для этого пять миллилитров положительного бульона для посева крови переливаются в пробирку для разделения сыворотки и центрифугируются. После отжима слой жидкости, содержащий бактерии, переносится в микроцентрифужную пробирку, а затем центрифугируется на низкой скорости. Затем надосадочная жидкость переносится в новую микроцентрифужную пробирку и центрифугируется на высокой скорости.

Полученная гранула ресуспендируется в муравьиной кислоте и анализируется maldi для идентификации присутствующих видов бактерий. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, подобными традиционным культурам, является более раннее выявление грамотрицательных бактерий. Применение этого метода распространяется и на клиническую микробиологию, поскольку диагноз бактериемии влияет на выбор противомикробного препарата, назначенного врачом.

Демонстрировать эту процедуру будет Леонардо Баску, один из техников нашего отдела, регулярно выполняющий эту процедуру. Аэробные или анаэробные бутылочки для посева крови, собранные по усмотрению клинического персонала, обычно в условиях лихорадочного заболевания, инкубируются в автоматизированных машинах, которые постоянно контролируют рост бактерий. Когда есть признаки роста во флаконе для посева крови, машина идентифицирует сигнализированный флакон.

Начните эту процедуру с извлечения сигнального флакона с посевом крови из инкубатора. Поместите его в шкаф биологической безопасности. Приготовьте окрашивание по Граму из сигнального бульона культуры крови в соответствии с местными институциональными протоколами, и исследуйте его с помощью микроскопии, если выявлены грамотрицательные организмы.

Обрабатывайте культуральный отвар по описанному здесь способу. Если грамположительные организмы идентифицированы, может быть использован альтернативный метод быстрых молекул. Переверните флакон с посевом крови два-три раза, чтобы перемешать.

Затем в шкаф биобезопасности. Прикрепите шприц объемом 10 миллилитров к безопасному устройству для переноса крови. Подложите устройство для переноса крови к флакону для посева крови и наберите пять миллилитров бульона в шприц.

Аспирированную культуру крови бульон поместить в сепарирующую пробирку для разделения сыворотки в центрифуге при 1,250 G в течение 15 минут для удаления эритроцитов. После вращения культура крови из аэробных бутылок показывает четкое разделение эритроцитов на дне пробирки, а граница раздела гелевой жидкости выглядит как непрозрачный белый цвет. Напротив, культура крови из литической анаэробной культуры крови выглядит как темно-красный цвет на границе раздела гелевой жидкости.

Поскольку лизированные компоненты эритроцитов остаются во взвешенном состоянии в надосадочной жидкости для любого типа аспирата и отбрасывают надосадочную жидкость с помощью стерильной пипетки для переноса, стараясь оставить примерно один миллилитр охристого слоя непосредственно над границей раздела гелевой жидкости. Далее с помощью стерильной пипетки аккуратно перемешайте последний один миллилитр жидкости buffy coat над гелевой поверхностью, а затем переложите весь объем в микроцентрифужную пробирку. Вращайте новую пробирку с температурой 288 G в течение 30 секунд с помощью пластиковой одноразовой пипетки для переноса объемом один миллилитр.

Переложите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку и выбросьте пробирку с гранулой. На этом этапе очень важно избежать переноса гранул. Это особенно важно для анаэробных культур крови, поскольку супинат остается пигментированным, и гранула не всегда хорошо видна.

Центрифугируйте образец при давлении 18, 407 раз G в течение одной минуты, а затем с помощью пипетки с тонким наконечником перенесите ее, отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, чтобы оставить как можно меньше остаточной жидкости без разрушения гранулы. Добавьте один миллилитр стерильной воды без ДНК и РНК и пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать остаточную гранулярную центрифугу. Ресуспендированный раствор при 18, 407 умноженных на G в течение одной минуты.

После центрифугирования используйте пипетку с тонким наконечником для аспирации и удаления надосадочной жидкости. Опять же, позаботьтесь о том, чтобы удалить как можно больше жидкости. Суспендируйте гранулу в 10 микролитрах 70%-ной муравьиной кислоты.

Для больших гранул может потребоваться увеличить объем муравьиной кислоты на 50–100%.Хорошо используя смесь для пипеток для обеспечения однородного раствора, при необходимости используйте наконечник пипетки, чтобы физически разрушить гранулу. Полученный раствор содержит концентрированные бактерии, выделенные из бульона культуры крови, который относительно свободен от клеток человека и от культуры крови С помощью пипетки инокулятируйте чистую целевую пластину maldi TOF двумя микролитрами приготовленной суспензии на целевое место. Подготовьте три целевых сайта для каждого образца, чтобы избежать случайной проблемы неудачных операций чтения.

Поместите пластину на край вытяжного шкафа, чтобы максимально увеличить поток воздуха через него, чтобы он быстро высох, обложите каждое высохшее пятно одним микролитром раствора матрицы. Дайте пластине для мишени высохнуть на краю вытяжного шкафа. Как и раньше, убедитесь, что однородный препарат заполняет каждое из целевых мест на тарелке.

Вставьте целевую пластину в масс-спектрометр Малоффа. Убедитесь, что пластина находится заподлицо с подпружиненными пластинами. Не вставляйте целевую пластину до тех пор, пока все целевые точки не высохнут.

Проверьте резиновый уплотнитель, чтобы убедиться, что на нем нет ворса, пыли и волос. Это позволит создать необходимые условия вакуума. Затем закройте крышку сцены maloff и нажмите кнопку входа-выхода на передней панели инструмента.

Крышка заблокируется, и создается вакуум. Откройте программное обеспечение maldi typ and flex control в программном обеспечении typ. В раскрывающемся меню с именем файл выберите новую классификацию, присвойте проекту имя, а затем нажмите кнопку новый.

Нажмите «Далее». Чтобы завершить настройку в окне программного обеспечения flex control, определите изображение целевой пластины на экране, удерживая нажатой левую кнопку мыши. Наведите мышь на инокулированные участки и выделите целевые места, которые используются.

Используйте правую кнопку мыши, чтобы щелкнуть в любом месте выбранных целевых позиций, а затем выберите «Добавить аналиты» в выпадающем меню. Для каждой из целевых точек добавьте идентификационные данные бактериологического исследования крови в столбец ID и нажмите кнопку «Далее». Когда все будет готово, выберите базу данных спектров коммерческой таксономии и выберите следующие лаборатории, которые могут использовать дополнительные внутренние или коммерческие базы данных для увеличения количества референсных спектров, нажмите «Готово», и MALDI TOF MS начнет генерировать спектры.

Иногда более высокие значения maldi to score могут быть достигнуты за счет использования ручного сбора maldi to spectra в программном обеспечении flex control. После того, как спектры будут получены и анализ будет завершен в программном обеспечении для создания стереотипов, нажмите кнопку с плюсом рядом с идентификацией видов. Чтобы расширить список идентификаций для каждой цели, изучите пять основных идентификаций, обращая внимание на то, похожи ли первые пять.

Если первые пять жанров не согласуются с баллами больше или равными 1,7 для одного и того же целевого места, может присутствовать смесь видов. Обратите внимание, что технология OV имеет низкую чувствительность для обнаружения смешанных видов. Когда оценка больше или равна 2,0 отмечена для наибольшего совпадения на целевом пятне, сообщите вид, когда наивысший балл на целевом месте больше или равен 1,7, но меньше 2,0, сообщите о гене.

Только если дополнительные критерии из пяти основных идентификаций согласуются, то отчитывайтесь на уровне вида. Когда все спектры будут завершены, нажмите кнопку входа-выхода на MALDI для обработки, откройте гнездо целевой пластины и снимите пластину. Если вы используете многоразовую мишенную пластину maldi TOF, используйте спирт для очистки всех целевых пятен и храните maldi to plate при комнатной температуре, как только она станет чистой и сухой, для идентификации грамотрицательных бактерий из бульона для посева крови были использованы циклы промывки отжимом для концентрации и изоляции бактерий, которые затем были проанализированы с помощью масс-спектроскопии MALDI TOF.

Как описано в этой видеостатье, здесь показаны спектры, сгенерированные MALDI TOF MS для эврики коли с логарифмической оценкой 1,86. Одно справа — первые пять совпадений, выявленных программным обеспечением для ввода текста. Обратите внимание, что вид постоянно сообщается как re-coli с оценкой 1,861.

Поскольку первые пять совпадений относятся к кишечной палочке, идентификация считается достоверной на уровне вида. Здесь показаны спектры, сгенерированные из MALDI в MS для аэрогена pseudomonas. Логарифмический балл равен 2,216 справа — это первые пять совпадений, выявленных программным обеспечением для набора текста.

Обратите внимание, что вид постоянно сообщается как pseudomonas aerogen с высоким баллом 2,216. Идентификация считается достоверной до видового уровня. Здесь справа показаны спектры, сгенерированные методом MALDI to MS для бульона со смешанной культурой крови, содержащего esia coli и SIO marsens

В первых пяти совпали спектры. Этот смешанный ген идентифицирован только примерно в одной трети культур смешанного бульона. В этой таблице обобщены ранее опубликованные результаты проверочного исследования этого метода, в котором 91,8% мономикробных бульонов достигли балла maldi менее 1,7 при 100% и 97% соответствии гениальности и виду соответственно.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как подготовить сигнальный флакон для посева крови для идентификации с помощью maldi toff. Следуя этому методу, мы можем использовать ту же гранулу, подготовленную для идентификации бактерий, для подготовки более стандартизированного инокля для автоматизированного тестирования восприимчивости. Например, этот метод позволяет лабораториям проводить раннюю диагностику клиницистам с потенциалом влияния на лечение.

Не забывайте, что работа с бутылочками для посева крови может быть опасной, и при работе с бутылочками для посева крови всегда следует использовать шкаф биологической безопасности.