От вокселей к знаниям: Практическое руководство по сегментации комплекс электронной микроскопии 3D-данных
13 августа 2014 г.
Узким местом для сотовой 3D электронной микроскопии является выделение признаков (сегментация) в очень сложных карт плотности 3D. Мы разработали набор критериев, который обеспечивает руководство в отношении которых сегментация подход (ручной, полуавтоматический или автоматизированная) лучше всего подходит для разных типов данных, обеспечивая тем самым отправной точкой для эффективной сегментации.
Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы сегментировать интересующие нас особенности из сложных наборов данных 3D-электронной микроскопии клеток и тканей для анализа их 3D-организации. Это достигается за счет сбора набора данных, состоящего из отдельных изображений электронной микроскопии. Затем необработанные 2D-данные реконструируются в 3D-объем и фильтруются для снижения шума и улучшения интересующих их функций.
Далее либо ручная абстрагирование, либо генерация модели, ручная трассировка интересующих признаков. Автоматическая сегментация на основе плотности или индивидуальная автоматическая сегментация выполняется для извлечения интересующих особенностей. Результаты показывают окончательные 3D-сегментированные модели интересующих объектов на основе сортировки характеристик изображений и личных целей для выбора оптимального подхода к сегментации.
Сравнение различных подходов для разных наборов данных поможет выбрать правильную стратегию сегментации. Мы демонстрируем различные методы извлечения интересующих признаков. Учитывая сложность объемов субклеточной электромикроскопии, каждый подход имеет свои преимущества и ограничения.
Как правило, люди, не знакомые с сегментацией, могут испытывать трудности, потому что определение наилучшего подхода для различных наборов данных не всегда ясно. Вместе с выпуском спермы для аспирантов. Тай, демонстрирующий процедуру, будет BU в качестве постдока автомобиля.
В моей лаборатории Амит Хассан, научный сотрудник моей лаборатории, и Хоакин Корея, инженер по компьютерным системам в моей лаборатории. Для начала импортируйте объем данных в подходящую программу. Для ручной генерации абстрактной модели в данной демонстрации используется программное обеспечение kymera.
Сначала выберите файл и откройте для вызова диалоговое окно «Открыть файл», перейдите к расположению файла на нужной карте. Затем откройте просмотрщик объема и выберите стиль отображения функций, чтобы отобразить данные с различными стилями рендеринга. Отрегулируйте порог для отображения, перетаскивая вертикальную полосу на гистограмме в окне просмотра объема.
Перемещайтесь по 3D-объему, чтобы выбрать область интереса для сегментации и при необходимости обрезать меньший подобъем. В диалоговом окне просмотра объема выберите функции, выбор подобласти, щелкните и перетащите, чтобы создать прямоугольную рамку вокруг интересующей области. Затем разместите маркеры вдоль интересующего объекта и соедините их с компоновщиками там, где это уместно, пока модель не будет готова.
Чтобы добиться этого, в строке меню просмотрщика громкости выберите инструменты, диалоговое окно трассировщика громкости. Чтобы открыть там диалог трассировщика объема, выберите файл, новый маркер. Набор. В диалоговом окне объемного трассировщика проверьте мышь, разместите маркеры на высокой плотности, разместите маркеры на данных, перемещайте и изменяйте маркеры, связывайте новый маркер с выбранным маркером и связывайте последовательно выбранные маркеры.
Затем в окне объемного трассировщика выберите маркеры размещения правой кнопкой мыши и вставьте радиусы для маркеров и ссылок. Затем щелкните правой кнопкой мыши по данным об объеме, чтобы начать закладывать маркеры. Маркеры будут подключаться автоматически в диалоговом окне трассировщика громкости.
Выберите файл, сохраните текущий маркер. Установите затем маркер закрытия файла. Набор. Откройте новый набор маркеров, чтобы начать построение модели во второй интересующий вас объект.
Используйте контрастные цвета между наборами маркеров, чтобы подчеркнуть различия в чертах. Ручная трассировка интересующих объектов – это трудоемкий подход, используемый при относительно небольшой плотности населения и когда точность извлечения признаков имеет первостепенное значение. Для начала импортируйте данные об объеме в программу с опциями ручной трассировки. Программное обеспечение.
С этой возможностью обычно предлагают базовый инструмент кистью. В этой демонстрации программное обеспечение Amira используется для больших томо. Выберите «Открыть данные» и щелкните правой кнопкой мыши по имени файла rec.
Затем нажмите на формат, выберите необработанные как большие данные диска. Ладно, и грузьте. Выберите подходящие параметры исходных данных из информации заголовка и нажмите OK.
Включите и сохраните как новое имя файла. am. Для последовательности 3D-изображений выберите «Открыть данные» и выберите имя файла tiff или имя файла dot mrmc.
Затем переключитесь, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Сохранить как имя файла». В окне 3D-просмотрщика выберите орто-срез, чтобы открыть файл изображения. Затем используйте ползунок внизу для навигации по срезам, чтобы обрезать большие данные, открытые как большие данные диска.
Переключите имя файла в окне пула, щелкните правой кнопкой мыши и выберите доступ к решетке. Введите желаемый размер коробки, переместите коробку в нужную область и нажмите применить. Сохраните новый файл.
Затем создайте файл сегментации, переключив файл в окне пула. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите поле маркировки метки. Новый файл будет создан и автоматически загружен во вкладке редактора сегментации, а также в пуле объектов.
С помощью инструмента «Кисть» обведите границу первого интересующего объекта. Измените размер кисти по своему усмотрению, а затем с помощью указателя мыши обведите границу интересующего объекта. Заполните область трассировки сочетанием клавиш F.Добавьте выделение, нажав кнопку с символом плюса.
Проследите за интересующим объектом во всех срезах и повторите сегментацию вручную. Сгенерируйте рендеринг поверхности для визуализации и базового качественного или количественного анализа в соответствии с инструкциями пользователя программного обеспечения на вкладке пула объектов, переключите метки имен файлов в окне пула. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Поколение поверхности».
Выберите нужные свойства поверхности и нажмите кнопку «Применить». В пуле будет создан новый файл с именем surf. Чтобы визуализировать сегментированный объем, переключите серфинг имени файла в окне бассейна.
Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Вид поверхности». Сгенерируйте поверхность для визуализации и качественного анализа, как описано в текстовом протоколе. Автоматизированная сегментация на основе плотности используется для наборов данных с любым разнообразием контрастности, четкости или переполненности для снятия интересующих плотностей и начала импорта объемных данных в программу, оснащенную волшебной палочкой пороговых значений или другими инструментами на основе плотности для автоматической сегментации.
Как и в методе ручной трассировки интересующих объектов, в этой демонстрации для объектов без четко различимых полей используется программное обеспечение Amira. Используйте инструмент порога, выбрав значок порога. Отрегулируйте ползунок, чтобы настроить плотность в нужном диапазоне, чтобы маскировались только интересующие вас объекты.
Нажмите кнопку выбора, затем добавьте выбор, нажав кнопку с символом плюса или с помощью ярлыка. Генерирует поверхность для визуализации и качественного анализа, как описано в текстовом протоколе. Все четвертое приближение.
Специально настроенная автоматизированная сегментация может использоваться для эффективной сегментации больших наборов данных, но для этого требуются знания в таких программах, как matlab. Обратитесь к дополнительному видео о специализированной сегментации для получения пошаговых инструкций по этому методу. Шесть примеров наборов данных были сегментированы с помощью четырех подходов. Ручная генерация абстрактной модели, ручная трассировка интересующих особенностей, автоматическая сегментация на основе плотности и индивидуальная автоматическая сегментация.
Встроенная окрашенная томография стереоцилий с целью создания модели для количественных целей, а не извлечения точных плотностей для встроенной смолы окрашенной томографии клеточной стенки растения. Автоматизированная сегментация на основе плотности оказалась наиболее эффективной для быстрого извлечения целлюлозы через множество срезов. Ручные методы требовали больше усилий только для нескольких срезов данных.
Ручная генерация абстрактной модели позволила получить триплет микротрубочек в стадийной томографии киноцилия, в то время как два автоматизированных подхода извлекали плотности быстрее и поэтому были предпочтительными из-за формы митохондрий из сфокусированных ионных пучков, сканирующей электронной микроскопии эпителиальных клеток молочной железы. Ручная трассировка обеспечила наиболее чистый результат, а низкая плотность населения позволила быстро провести сегментацию. Учитывая большой объем, который необходимо было сегментировать, индивидуальная автоматическая сегментация оказалась наиболее эффективной для сегментации данных о бактериях серийного сканирования лица с помощью электронной микроскопии.
Несмотря на трудоемкость, единственным методом извлечения сфокусированного ионного пучка сканирующей электронной микроскопии мембраны эпителиальных клеток молочной железы была ручная трассировка. Разработка подходов к сегментации открывает исследователям в этой новой области структурной клеточной биологии путь к исследованию и определению клеточной 3D-архитектуры на уровне макромолекулярных комплексов, органелл и клеток в большом разнообразии клеточных культур, органоидных культур или модельных организмов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как выбрать и применить оптимальный подход к сегментации для вашего набора данных.
Обзор
Данное исследование посвящено решению проблем извлечения признаков из данных трехмерной электронной микроскопии. В нем представлен набор критериев, призванных помочь исследователям в выборе наиболее подходящего метода сегментации для различных типов данных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Электронная микроскопия
Теоретические основы
- 3D электронная микроскопия позволяет детально изучить клеточные структуры.
- Сегментация имеет решающее значение для анализа сложных трехмерных карт плотности.
- Различные методы сегментации включают ручные, полуавтоматические и автоматизированные подходы.
- Выбор подходящего метода может быть сложной задачей для исследователей.
Цель исследования
- Для сегментации интересующих объектов из сложных трехмерных наборов данных электронной микроскопии.
- Для оценки характеристик данных с целью обоснования выбора методов сегментации.
- Для сравнения различных стратегий сегментации с целью оптимизации извлечения признаков.
Используемые методы
- Сбор отдельных изображений электронной микроскопии.
- Реконструкция исходных 2D-данных в 3D-объем.
- Фильтрация для снижения уровня шума и усиления признаков.
- Оценка характеристик данных для выбора метода сегментации.
Основные результаты
- Продемонстрированы различные методы извлечения признаков.
- Представлены итоговые 3D-модели сегментации, полученные с использованием выбранных стратегий сегментации.
- Рассмотрены преимущества и ограничения каждого подхода к сегментации.
- Приведены рекомендации для исследователей, начинающих работу с сегментацией.
Выводы
- Эффективная сегментация имеет решающее значение для анализа данных трехмерной электронной микроскопии.
- Выбор подходящего метода зависит от конкретных характеристик набора данных.
- Данное исследование предлагает основу, позволяющую исследователям совершенствовать методы сегментации.
Часто задаваемые вопросы
Практическое значение для промышленности
В биофармацевтических исследованиях и разработках точный ультраструктурный 3D-анализ клеточных компонентов имеет решающее значение для валидации мишеней и снижения рисков при изучении механизмов. Данное руководство представляет собой основу для принятия решений по выбору оптимальных стратегий сегментации на основе характеристик данных, что напрямую способствует воспроизводимому фенотипическому скринингу и разработке анализов. Обеспечивая точную визуализацию и количественную оценку макромолекулярных комплексов и органелл, этот подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей и снижает биологическую неопределенность на ранних этапах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выяснения трехмерной организации адгезионных комплексов и структур цитоскелета.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет функциональной валидации мишеней путем прямой визуализации макромолекулярных машин в нативном контексте.
- Прогностическая ценность: оптимизирует отбор проектов в портфеле, предоставляя количественные структурные данные для оценки взаимодействия с мишенью и механизма действия.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет подготовить валидированные биологические системы для последующих этапов анализа путем создания воспроизводимых трехмерных сегментированных моделей органелл и клеточных структур.
- Практическая ценность: решает вопросы стандартизации и масштабируемости анализа за счет обеспечения согласованного рендеринга поверхностей и получения количественных результатов анализа.
- Стратегическая ценность: обеспечивает надежную оценку соединений, гарантируя готовность к сегментации различных наборов данных с разным соотношением сигнал/шум и плотностью признаков.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обсуждается значимость для изучения заболеваний путем установления связи между ультраструктурными изменениями органелл и патофизиологическими механизмами в модельных системах.
- Практическая ценность: Описывается преемственность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет обеспечения возможности кросс-платформенного сравнения результатов сегментации.
- Прогностическая ценность: Основное внимание уделяется снижению механистических рисков путем уменьшения неоднозначности при интерпретации целевого пути за счет объективного извлечения признаков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс исследований: от проверки гипотез на ранних этапах изучения биологии до идентификации перспективных соединений и доклинической валидации, обеспечивая принятие решений на каждом этапе на основе данных с высокой точностью воспроизведения ультраструктуры.
- Фундаментальная биология: объясняется, как данный метод способствует проверке гипотез, уточнению путей передачи сигналов и снижению биологических рисков за счет обеспечения прямой визуализации взаимодействий структур в 3D-пространстве.
- Скрининг: описываются готовность анализа, воспроизводимость и количественные результаты посредством стандартизированного рендеринга поверхности и извлечения признаков при использовании ручных, полуавтоматических и автоматизированных подходов.
- Аналитика: освещаются измерения, результаты считывания и статистические показатели, такие как объем, площадь поверхности и морфологические параметры, которые помогают исследовательским группам сравнивать условия и оценивать эффекты соединений.
- Трансляционные исследования: метод связывается с преклинической преемственностью и согласованием биомаркеров путем установления связи между ультраструктурными фенотипами и функциональными исходами в системах, релевантных для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: метод представляется как многократно используемая возможность, а не как однократная техника, что обеспечивает стандартизацию между проектами и передачу знаний между исследовательскими группами.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: прогностическая достоверность, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах.
- Влияние на портфель: приоритезация и решения о продвижении проектов с учетом рисков.
Особенности внедрения
- Необходимый уровень научных знаний в области ультраструктурной биологии и интерпретации 3D-данных.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая платформы для ЭМ-визуализации и программное обеспечение для сегментации (например, Amira, Kymera, MATLAB).
- Требования к межкомандной стандартизации для обеспечения единообразного подбора пороговых значений, трассировки и применения алгоритмов в разных центрах.
- Особенности адаптации методов для различных модельных систем, таких как клетки, ткани, органоиды и модельные организмы.
- Практические ограничения, включая временные затраты при использовании ручных методов и вычислительные ресурсы для специализированных автоматизированных конвейеров обработки данных.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
4:47
Manual Tracing of Features of Interest
2:04
Manual Abstracted Model Generation
8:10
Automated Density-based Segmentation
9:15
Custom-tailored Automated Segmentation
9:41
Results: Application of Four Segmentation Approaches to Example Data Sets
11:29
Conclusion
