Корреляционный конфокальной и 3D Электронная микроскопия конкретного чувственного Cell

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы задокументировать полную ультраструктуру специфической сенсорной клетки кишечника, рассеянной среди других эпителиальных клеток в нативной кишечной ткани. Это достигается путем предварительного получения сегмента ткани размером 300 на 50 микрон из кишечника. Далее с помощью конфокальной микроскопии получают оптические стеки Z сегмента.

Затем конфокальные данные служат руководством для обработки и визуализации ткани с помощью последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии или SBEM. Наконец, данные SBEM сегментируются для визуализации ультраструктуры конкретной сенсорной клетки кишечника в 3D. В конечном счете, корреляционная конфокальная микроскопия и сканирование лица с последовательным блоком.

Электронная микроскопия используется для того, чтобы показать конкретную клетку в ее родной ткани и выявить ее ультраструктуру в 3D. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, такие как конкретные межклеточные взаимодействия, которые невозможно было бы визуализировать на уровне световой микроскопии. Используя этот метод, мы ранее сообщали о скрытой физико-химической связи между сенсорными входными эндокринными клетками и входящими в ggl.

После изоляции толстой кишки мыши, согласно текстовому протоколу, поместите ее в красивую холодную PBS и, погружаясь в воду, разрежьте ткань вдоль брыжейки, перенесите ткань в несколько капель PBS на лист стоматологического воска и с помощью скальпеля облейте около шести небольших сегментов ткани из дистального отдела толстой кишки. После приготовления 5% низкоплавких аров в PBS используйте его для встраивания сегментов ткани в небольшой пластиковый контейнер, такой как криоформа для тканей стандартного размера, установите встроенные секции на микротом с вибрирующим лезвием и используйте ледяной PBS для заполнения буферного лотка. Затем нарежьте полоски ткани 300 микрон с амплитудой 0,8 и скоростью 0,04 миллиметра в секунду.

Сверните тканевые полоски размером 300 микрон в арос и закрепите их на микротоне перпендикулярно лезвию. Затем разрежьте полоски ткани толщиной 50 микрон, обратившись к текстовому протоколу для уточнения деталей, перед тем как сохранить блоки в PBS при температуре четыре градуса Цельсия. После визуализации тканевых блоков с помощью конфокальной микроскопии в соответствии с текстовым протоколом для инфильтрации и встраивания срезов тканей в смолу.

Извлеките ткань из PBS и используйте буфер 0,1 молярного покрытия, чтобы прополоскать ее три раза по пять минут каждый. После того, как смола подготовлена и ткани окрашены для электронной микроскопии, в соответствии с текстовым протоколом, используйте ее для сэндвич-блоков тканей между предметными стеклами, отвержденными жидким разделительным агентом после того, как блоки тканей были встроены, отверждайте блоки в течение дополнительных 48 часов при температуре 60 градусов Цельсия. Затем раздвиньте предметные стекла, чтобы освободить блоки под препарирующим эндоскопом, сопоставьте ориентацию тканевых блоков, встроенных в смолу, с ориентацией конфокальных микрофотографий.

Чтобы облегчить идентификацию областей, содержащих интересующие клетки, установите блок на штифт, содержащий проводящую эпоксидную смолу, и высушите в течение 30 минут. Затем положите блок на поверхность и высушите в течение ночи при температуре 60 градусов Цельсия на следующий день. Смажьте блок жидкостью коллоидного серебра.

Поддерживайте плоские срезы тканей, чтобы обеспечить срез блока под прямым углом, чтобы облегчить корреляцию лицевой стороны серийного блока и конфокальных микрофотографий. После проведения сканирующей электронной микроскопии в соответствии с текстовым протоколом преобразуйте изображения SPEM из необработанных изображений в формате DM трех формата в восьмибитные изображения TIFF с помощью фильтра размытия 0,8 Гаусса на Фиджи. Отфильтруйте изображения в формате TIFF.

Уменьшите масштаб набора данных до 25% от исходного размера и сохраните его в виде стека TIFF, чтобы свести к минимуму объем оперативной памяти, необходимый для обработки набора данных, с помощью линейного выравнивания стека плагина Fiji с фильтрацией в режиме трансляции. Выровняйте стопку изображений SPEM и используйте плагин обрезки 3D для их обрезки. Чтобы отобразить данные, используйте инструмент «Поверхности» в режиме рисования и параметр «Контур» в режиме рисования продолжительностью 50 миллисекунд, чтобы вручную сегментировать и отобразить интересующую ячейку в объеме.

Обведите контуры на каждом срезе ячейки для более плавного рендеринга или на каждых пяти срезах для более быстрого рендеринга. Используйте инструмент «Моментальный снимок» для экспорта окончательных изображений с разрешением 300 DPI или более с помощью мыши P-Y-Y-G-F-P. Все энтероэндокринные клетки дистального отдела тонкой кишки идентифицируются и обрабатываются для SBEM, как показано здесь.

Выбранный сегмент ткани был визуализирован с помощью конфокальной микроскопии для получения изображений Зака, которые оптически удалены друг от друга на один микрон. Оптимизация размеров тканевых блоков имеет решающее значение для топографической корреляции между конфокальными данными и данными SBEM. На этом объемном снимке энтероэндокринной клетки в подвздошной кишке мыши видна заметная нейростручка, простирающаяся под эпителиальными клетками примерно на 60 микрон.

Соотнося конфокальные стеки Z с SBEM-изображением всей поверхности блока, представляющая интерес клетка идентифицируется здесь в блоке из дистального отдела толстой кишки мыши A-P-Y-Y-G-F-P. Важно, чтобы ориентация блока была как можно более плоской, чтобы оптические срезы на изображениях SBEM совпадали. После того, как клетка была идентифицирована, визуализация SBEM выполняется с разрешением, достаточно высоким для идентификации секреторных слусов и других клеточных органелл.

Это видео содержит рендеринг энтероэндокринной клетки в 3D. Датасет содержит 643 изображения, которые охватывают 45 микрон глубины ткани. Клетка содержит нейрокапсулу, наполненную секреторными лесами, а также микроворсинками.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как задокументировать полную ультраструктуру конкретного кишечника Сенсорная клетка рассеивается среди других эпителиальных клеток в нативной кишечной ткани, используя флуоресценцию в качестве руководства для идентификации интересующей клетки или клеток и обработки ткани для серийной блочной фазовой сканирующей электронной микроскопии.