Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы сравнить способность макрофагов контролировать рост ceto fungal candia ex vivo. Это достигается путем предварительного мечения альвеолярных макрофагов in vivo липофильным красителем PKH 26. Вторым этапом процедуры является забор альвеолярных макрофагов у привитых мышей с помощью бронхоальвеолярного лаважа.

Третьим шагом является культивирование и сбор GFP-положительных грибковых спор. Заключительными шагами являются испытания макрофагов GFP-положительными кандиями и фиксированными клетками в заранее определенные моменты времени. В конечном счете, с минимальными манипуляциями с клетками ex vivo, конфокальная микроскопия может выявить способность альвеолярных макрофагов контролировать рост фагоцитозы.

Споры Сначала разбавьте липофильный краситель P HK 26, от 1 до 5. В разбавителе С краситель будет поглощаться кислотными клетками FOC. Загрузите 100 микролитров разведенного P HK 26 в шприц объемом в полкуб. см и введите краситель внутривенно ретроорбитально или через хвостовую вену.

Подсчитайте, что каждая мышь даст от трех до 500 000 меченых макрофагов через 10 дней. Усыпите мышей и приготовьтесь к вскрытию грудной полости из диафрагмы. Вырежьте небольшое отверстие в грудной клетке справа от грудной клетки, чтобы сдуть легкие и для последующего наблюдения за надуванием легких.

Затем найдите и изолируйте трахею от окружающих тканей. Затем с помощью изогнутых щипцов аккуратно вырезать адвентицию, которая покрывала трахею. После обнажения вставьте катетер в трахею.

Очень важно избегать прокола трахеи. При выполнении этого маневра закрепите катетер швом длиной 10 сантиметров, обмотанным вокруг трахеи. Затем извлеките иглу из катетера.

Далее наполните шестимиллилитровый шприц жидкостью для промывания и прикрепите его к четырехпозиционному стопорному крану. Приложите пустой шестимиллилитровый шприц в другом положении и аккуратно подсоедините открытый порт к катетеру. Когда сборка на месте, откройте стопорный кран до полного шприца и медленно введите в легкие около одного миллилитра раствора.

Далее поверните стопорный кран, чтобы закрыть шприц и выпустить жидкость. Затем осторожно извлеките богатую макрофагами легочную жидкость, наблюдая за тем, как легкие сдуваются. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока весь раствор не будет введен в легкие и собран из них.

Ожидайте некоторой потери жидкости. Вы не сможете удалить жидкость из легких, если катетер находится в неправильном положении. Осторожно перемещайте катетер вперед и назад до тех пор, пока жидкость не сможет легко выводиться из легких.

Следите за тем, чтобы катетер не выпал. Затем перелейте собранную жидкость для промывания в коническую форму объемом 50 миллилитров для сбора клеток, центрифугируйте жидкость при 300 G в течение пяти минут. При комнатной температуре слейте надосадочную жидкость и при желании сохраните ее для анализа на цитокины.

Ресуспендируйте клетки в одном-пяти миллилитрах RPMI 1640 с 10% FBS и определите их плотность. По крайней мере, 95% клеток должны быть макрофагами для культуры. Aspergillus fumigatus экспрессирует инфузию мозга и сердца GFP Berran.

Агрокосы обрабатывают 0,05 грамма левомицетикола и 0,5 грамма гентамицина на литр. Инкубируйте гриб на наклонных неплотно закрытых крышках в темноте и при комнатной температуре. Через семь-10 дней соберите урожай, промыв каждый наклон 10 миллилитрами 0,01% Твин 20 в DPBS используйте STR PET для разрыхления грибка и используйте несколько полосканий для увеличения урожая.

Пропустите суспензию через сетчатое фильтр 100 микрон и соберите фильтрат, содержащий кедию. В коническом бассейне объемом 50 миллилитров кедия с 10-минутным отжимом при 400 G при комнатной температуре. Затем ресуспендируют их в 50 миллилитрах DPBS и определяют их концентрацию с помощью гемоцитометра.

Наконец, еще дважды промойте кедию DBBS и снова суспендируйте их в нужной концентрации. Первые покровные стекла и пластины должны быть подготовлены под шкафом биологической безопасности. Замочите 22-миллиметровую квадратную крышку в 70% этаноле на пять-10 минут.

Затем промойте их в PBS для каждой временной точки обработки, используйте щипцы, чтобы аккуратно поместить одну стерилизованную крышку в лунки шестилуночного планшета, загрузите лунку для каждого состояния, проверенную на каждую крышку, засемените около 1 миллиона меченых макрофагов PKH 26 в 300 микролитрах RPMI 1640 с 10% FBS инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение ночи. На следующее утро на каждую сидячую крышку наклеивают 10 миллионов GFP экспрессии aspergillus fuma Gattis kedia в 100 микролитрах теплого RPMI 1640 с 10% FBS. Верните планшеты в инкубатор на время испытания и зафиксируйте ячейки через заранее определенные промежутки времени, чтобы получить результаты.

Чтобы закрепить пластину из клеток, добавьте по одному объему 2%-ного формальдегида в каждую лунку и дайте пластине постоять два часа при комнатной температуре. Через два часа переместите пластину на четыре градуса Цельсия, пока другие пластины также не будут закреплены. Сначала подготовьте предметное стекло с шестью микролитрами флуоресцентного монтажного носителя с помощью dappy Когда все пластины будут зафиксированы, аккуратно снимите покровные стекла с помощью щипцов и промойте их в ванне DPBS в течение минуты.

Затем промокните их края, чтобы удалить лишнюю жидкость. Далее аккуратно укладываем крышку, опускаем вниз в подготовленный ранее на стеклостекле монтажный материал. Нет необходимости нажимать на предметное стекло, чтобы среда распространилась.

Заклейте предметное стекло лаком для ногтей и дайте ему высохнуть на воздухе. Храните предметные стекла при комнатной температуре в темноте до тех пор, пока их можно будет просматривать в естественных условиях. Меченый альвеолярный.

Макрофаги собирали, а затем подвергали грибковой провокации. Мыши дикого типа и мыши, несущие мутацию в N-A-D-P-H. Оксидазы использовались для сбора макрофагов через три или семь часов.

Фагоцитоз был схожим у дикого типа и мутантных штаммов. Клетки, содержащие кандию, положительную как на PKH 26, так и на GFP, были в изобилии во всех трех генотипах, однако через 14 часов появились различия в способности макрофагов контролировать рост фагоцитированных Candia. Было обнаружено много интактных макрофагов дикого типа, содержащих фагоцитированную кандию.

Это наблюдалось и в клетках с функциональным ферментом N-A-D-P-H в клетках с NCF. Фон Напротив, интактные альвеолярные макрофаги, лишенные N-A-D-P-H-оксидазы, были редкими, что позволяет предположить, что Phace toast Kedia вырос, разрушая клетки. Это также говорит о том, что контроль роста фекального тоста Kedia является N-A-D-P-H-оксидазой