Экспрессия рекомбинантных Целлюлаза Cel5A от

Общая цель следующего эксперимента заключается в транзиентной экспрессии целевых белков в табаке, чтобы оценить возможность экспрессии ферментов в растениях в короткие сроки. Данная транзиентная экспрессия достигается путем инфильтрации листьев табака штаммом Agrobacterium tumefaciens, содержащим вектор с интересующим геном. На втором этапе, после инкубации, инфильтрированные листья растений собирают, а белковые экстракты подвергают частичной очистке для получения рабочего раствора фермента. Затем проводится анализ белков, чтобы оценить влияние экспрессии в растениях на фермент и подтвердить его ферментативную активность.

Получены результаты, демонстрирующие размер белка, возможные эффекты гликозилирования и ферментативную активность на основе вестерн-блоттинга, анализа zy и анализа деградации субстрата. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы о конверсии растительной биомассы, а также дать представление об активности ферментов после их транзиентной экспрессии в табаке. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы инфильтрации трудно освоить из-за того, что листья легко повреждаются шприцем, и я буду проводить эксперименты в стерильных условиях.

Перенесите отдельные колонии agrobacterium в колбу Эрленмейера, содержащую 10 milliliters дрожжевого экстрактного бульона с антибиотиками. Инкубируйте инокулированный бульон в течение 36–40 часов при температуре 26 degrees Celsius и перемешивании со скоростью 180 RPM. Затем внесите по 200 microliters каждой культуры в 20 milliliters дрожжевого экстрактного бульона с теми же антибиотиками, что и ранее, и инкубируйте в тех же условиях в течение 36–40 часов.

Индуцируйте культуры, добавив 2 µL ацетофенона, 100 µL 40% раствора глюкозы и 200 µL 1 M MES-буфера при pH 5.6, и продолжите инкубацию в течение ночи. Затем возьмите растения из теплицы и с помощью наконечника пипетки сделайте надрез на абаксиальной стороне третьего–пятого листа сверху, чтобы облегчить инфильтрацию. После этого наполните шприц средой для инфильтрации и приложите его к одному из ранее сделанных надрезов.

Придержите шприц пальцем со стороны оси листа и осторожно введите среду в зону внутрилистовых вен. Чтобы визуализировать флуоресценцию в срезах листьев, экспрессирующих TR cell 5:00 AM cherry, осветите растения переносным источником зеленого света. При наблюдении через красный фильтр флуоресценция TR cell 5:00 AM cherry будет четко видна.

Для экстракции экспрессированных белков отберите листья табака, инфильтрированные AUM, содержащим P track ERTR cell five A, и нарежьте их кусочками по 1 г. Затем поместите их в предварительно охлажденную ступку и добавьте в образцы соответствующее количество жидкого азота. Разотрите листья в порошок с помощью пестика.

Повторите процедуру с неинфильтрированными листьями табака для получения контрольных образцов. Затем добавьте два миллилитра PBS, содержащего 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, к измельченной ткани листа и перемешивайте до тех пор, пока большая часть ткани листа не перейдет в суспензию. Центрифугируйте экстракт при 15 000 ×g в течение 20 минут при температуре 4 °C.

Затем удалите осадок, частично очищенные клетки TR cell five A, инкубируя белок, содержащий S natin, при 55 °C в течение 10 минут, после чего оставьте его при комнатной температуре еще на 10 минут. Затем центрифугируйте SNAT при 15 000 ×g в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите осадок и используйте белок, содержащий snat, для всех последующих этапов.

Дальнейшие анализы. Также проведите процесс частичной очистки для неинфильтрированных растений для получения контрольных образцов. В данной процедуре смешайте этилцеллюлозу и воду для получения 1,5% раствора и инкубируйте при перемешивании до полного растворения.

Для приготовления геля A-C-M-C-S-D-S для электрофореза в ПААГ замените один миллилитр воды на один миллилитр 1,5% CMC в 10 миллилитрах раствора смеси для SDS-геля и залейте гель обычным способом; затем денатурируйте образцы путем кипячения в присутствии SDS. Проводите электрофорез при напряжении 200 вольт в течение 50 минут, пока фронт красителя не достигнет нижней границы геля. После этого выполните рефолдинг белка непосредственно в геле 15% C-M-C-S-D-S.

Используйте 1,5% бета-циклодекстрин в 20 мМ фосфатно-цитратном буфере при pH 6,5. Инкубируйте гель в этом растворе при комнатной температуре при осторожном встряхивании в течение 15 минут. Удалите раствор бета-циклодекстрина и кратко промойте гель водой, затем инкубируйте при комнатной температуре в 50 мМ натрий-ацетатном буфере при pH 4,8 еще в течение 15 минут.

Затем проведите анализ CMC zy, используя рефолдированный 15%C-M-C-S-D-S ПААГ, инкубируя гель в 30 мМ натрий-ацетатном буфере в течение 20 минут при 50 °C. Для визуализации зон деградации CMC окрасьте гель в течение 10 минут 0,1% раствором конго красного и проведите деколоризацию 1 М раствором хлорида натрия в течение 30 минут или до появления четких полос; в конце промойте гель 0,3% уксусной кислотой. Для получения более четких изображений непосредственно перед проведением анализа подготовьте 2-кратный рабочий раствор четырех MUC и донесите по 100 µL рабочего раствора четырех MUC в отдельные лунки 96-луночного планшета.

Затем добавьте по 100 µL каждого образца в соответствующие лунки, проводя анализ каждого образца в трех повторностях при длине волны возбуждения 360 nm и длине волны эмиссии 465 nm. Определите уровень флуоресценции в начальной временной точке (0 мин) методом флуоресцентной спектроскопии. Далее инкубируйте планшеты, закрытые адгезивными крышками, при температуре 50 °C в течение 20 минут.

Затем остановите реакцию путем замораживания. После этого измерьте конечную флуоресценцию, используя те же параметры, что и для временной точки ноль минут. Вычтите значение флуоресценции в момент ноль минут из значения флуоресценции через 20 минут, чтобы определить изменение флуоресценции, вызванное ферментативной активностью непосредственно перед проведением анализа.

Приготовьте 2-кратный рабочий раствор A-O-C-M-C. Затем смешайте 50 µL образца и 50 µL рабочего раствора в пробирке объемом 1.5 mL. После этого инкубируйте образцы в течение 20 минут при 50 °C.

Остановите реакцию, добавив 250 µL осаждающего раствора. После этого интенсивно перемешайте каждый образец на вортексе в течение 10 секунд, чтобы обеспечить полное смешивание образца с осаждающим раствором. Затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут, снова перемешайте их на вортексе и центрифугируйте при 1000 Gs в течение 10 минут.

После этого осторожно перенесите по 200 µL SNAT из каждого образца в 96-луночный планшет. Ферментативная активность осадка проявляется в более высоком уровне растворенного красителя. Измерьте этот показатель с помощью абсорбционной спектроскопии при длине волны 590 нм.

На этом этапе поместите кружки фильтровальной бумаги в пробирки объемом 1,5 или 2 мл. Добавьте на кружки фильтровальной бумаги 100 µL 60 мМ ацетата натрия и 100 µL образцов, затем инкубируйте в течение 20 часов при 50 °C с перемешиванием при 300 RPM.

Кроме того, непосредственно перед проведением анализа инкубируйте отдельные образцы без фильтровальной бумаги в качестве контроля. Приготовьте рабочий раствор PABA с кратностью 1,5, содержащий 1 мл раствора PABA A и 9 мл раствора PABA B. Храните на льду до использования. Затем подготовьте образцы в термостабильных пробирках объемом 0,5 мл.

Образцы состоят из 45 µL воды, пяти µL каждого раствора, инкубированного с фильтровальной бумагой, и 100 µL рабочего раствора PABA. После этого проанализируйте контроли образцов и пять стандартов, приготовленных аналогичным образом. Затем инкубируйте образцы, контроли и стандарты ровно 10 минут при 100 °C и охлаждайте при комнатной температуре еще в течение 10 минут.

Пипеткой перенесите 100 µL раствора в 96-луночный планшет и проведите анализ с помощью спектрофотометра при длине волны 410 нм. Вычтите значения контрольных образцов из значений образцов фильтровальной бумаги, чтобы определить количество высвободившихся восстанавливающих сахаров. Ниже приведено изображение, демонстрирующее экспрессионные кассеты, а также экспрессию белка в растениях табака.

Так выглядит инфильтрированный лист табака при обычном свете и при зеленом свете с красным фильтром, где отчетливо видна экспрессия TR cell 5:00 AM cherry, отмеченная красным цветом. SDS-PAGE гель, вестерн-блот и зимограмма CMC, демонстрирующие размер и активность T cell five A. Общие растворимые белки были разделены, и мы можем визуализировать их с помощью окрашивания кумасси синим; вестерн-блоттинг по области гистидинового тега T cell five A подтверждает размер белка, а активность целлюлазы по отношению к CMC показана на зимограмме, окрашенной конго красным. Здесь представлены общие растворимые белки из листьев табачного растения, в которых ранее transiently экспрессировался TR cell five A, до и после очистки термическим осаждением, где TR cell five A представляет собой самую крупную видимую полосу и также виден на вестерн-блоте и зимограмме CMC.

Мы также видим общие растворимые белки растений табака, в которых Tcell five A не экспрессировался, после термического осаждения, а также белки из коммерчески доступной смеси tresa cellulase. На этом рисунке показано количественное определение ферментативной активности TR cell five A; TR cell five A инкубировали с 4 MUC Azo CMC или фильтровальной бумагой, и деградацию субстрата измеряли по высвобождению азокрасителя fluoro four four mu или путем количественного определения восстанавливающих сахаров по изменению цвета PBA после выполнения данной процедуры. Для получения дополнительной информации о том, как локализация белка может влиять на стабильность и активность фермента, могут быть использованы другие методы, такие как таргетинг белков.

Посмотрев это видео, вы должны получить четкое представление о том, как осуществлять транзиентную экспрессию белков в табаке, а также базовые знания о методах оценки ферментативной активности для конверсии целлюлозной биомассы.