Экспрессия рекомбинантных Целлюлаза Cel5A от Trichoderma reesei В растениях табака

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы временно экспрессировать целевые белки в табаке, чтобы получить представление о возможности экспрессии растительных ферментов в короткие сроки. Эта временная экспрессия достигается путем инфильтрации листьев табака штаммом агробактерии fain, который содержит вектор, включающий интересующий ген в качестве второго этапа. Затем проводится анализ белка для оценки влияния экспрессии растительного продукта на фермент и проверки его ферментативной активности.

Получены результаты, которые показывают возможные эффекты гликозилирования размера белка и ферментативную активность на основе вестерн-блоттинга, Zy и анализов деградации субстрата. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о преобразовании биомассы растений, а также может дать представление об активности ферментов после их временной экспрессии в табаке. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы инфильтрации трудно освоить из-за того, что листья легко повреждаются шприцем и одеждой, и я буду проводить эксперименты в стерильных условиях.

Переложите одиночные колонии агробактерий тоана в колбу Эрленмейера, содержащую 10 миллилитров. Дрожжевой экстракт отвара с антибиотиками. Затем инкубируйте инокулированный бульон в течение 36-40 часов при температуре 26 градусов Цельсия со скоростью 180 об/мин, встряхивая далее, инокулируйте по 200 микролитров каждой культуры в 20 миллилитров отвара дрожжевого экстракта теми же антибиотиками, что и раньше, и инкубируйте в тех же условиях через 36-40 часов.

Индуцировать культуры двумя микролитрами ацетофенона, 100 микролитрами 40% раствора глюкозы и 200 микролитрами одного молярного буфера MES при pH 5,6 и продолжить инкубацию в течение ночи. Теперь возьмите растения из теплицы и с помощью наконечника пипетки надрежьте осевую сторону AB от третьего по пятый лист от верхней части растения, чтобы облегчить проникновение. Затем наполните шприц инфильтрационной средой и поместите его на одну из ранее сделанных зазубрин.

Поддержите шприц пальцем на стороне листа аксио и осторожно введите средство в зону листа внутривенно. Для визуализации флуоресценции в срезах листьев, экспрессирующих TR клетки 5:00 AM вишни, посветите на растения портативным источником света, излучающим зеленый свет. При просмотре через красный фильтр будет четко видна флуоресценция от ячейки TR 5:00 AM вишни.

Чтобы извлечь экспрессированные белки, выберите листья табака, которые были инфильтрированы AUM, содержащим P track ERTR клетку 5 А, и разрежьте их на кусочки весом в один грамм. Далее поместите их в предварительно охлажденную ступку и добавьте к образцам соответствующее количество жидкого азота. Измельчите листья в порошок с помощью пестика.

Повторите процесс с неинфильтрованными табачными листьями, чтобы получить контрольные образцы. Затем добавьте два миллилитра PBS, содержащего один миллимолярный фенилметилсульфуен фторид, к измельченному веществу листьев и перемешайте до тех пор, пока большая часть вещества листьев не окажется во взвешенном состоянии. Центрифугируйте экстракт при 15 000 GS в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем отбраковывают гранулы, частично очищенные TR клетки 5 А, инкубируя белок, содержащий S-натин, при температуре 55 градусов Цельсия в течение 10 минут и дают ему отдохнуть при комнатной температуре еще 10 минут. Затем центрифугируйте SNAT при давлении 15 000 GS в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте гранулу и используйте для всех содержащую белок.

Дальнейшие анализы. Также выполните процесс частичной очистки для неинфильтрированных растений для получения контрольных образцов. При этой процедуре смешать этилцеллюлозу и воду до получения 1,5%-ного раствора и инкубировать при помешивании до полного растворения.

Для изготовления геля A-C-M-C-S-D-S замените один миллилитр 1,5%-ного КМЦ на один миллилитр воды в 10-миллилитровом растворе гелевой смеси SDS и влейте гель обычным образом, затем денатурируйте образцы, кипячив их в присутствии SDS. Проводите электрофорез при напряжении 200 вольт в течение 50 минут, пока фронт красителя не достигнет дна геля. Теперь проведите в геле рефолдинг белка на точке 15%C-M-C-S-D-S страницы геля.

Использование 1,5% бета-циклодекстрина в буфере из 20 миллимолярного фосфата цитрата при pH 6,5. Выдержите гель в этом растворе при комнатной температуре с легким встряхиванием в течение 15 минут. Выбросьте раствор бета-циклодекстрина и кратковременно промойте гель водой, инкубированной при комнатной температуре в буфере из ацетата натрия 50 миллимоляров при pH 4,8, в течение еще 15 минут.

Затем выполните CMC zy с использованием свернутой точки 15% C-M-C-S-D-S геля путем инкубации геля в 30 миллимолярном буфере из ацетата натрия в течение 20 минут при температуре 50 градусов Цельсия. Чтобы визуализировать, где разложился КМЦ, окрашивайте гель в течение 10 минут с помощью 0,1% раствора красного Congo и задерживайте его с помощью одного моляра хлорида натрия на 30 минут или до тех пор, пока в конце не появятся четкие полосы, промойте гель 0,3% уксусной кислотой. Для получения более четкой визуализации непосредственно перед проведением анализа приготовьте пипетку из четырех рабочих растворов MUC с двумя X и 100 микролитрами четырех рабочих растворов MUC в отдельные лунки 96-луночного планшета.

Затем добавьте по 100 микролитров каждого образца в соответствующие лунки, запуская каждый образец в трех экземплярах, используя длину волны возбуждения 360 нанометров и длину волны излучения 465 нанометров. Определите точку нулевой минуты для четырех мю флуоресценции с помощью флуоресцентной спектроскопии. Далее инкубируйте тарелки, накрытые клейкими крышками, при температуре 50 градусов Цельсия в течение 20 минут.

Впоследствии остановите реакцию путем замораживания. После этого измерьте конечную мю флуоресценцию, используя те же параметры, что и для временной точки нулевой минуты. Вычтите значение флуоресценции в ноль минут из значения флуоресценции в 20 минут, чтобы определить изменение флуоресценции, вызванное ферментативной активностью непосредственно перед проведением анализа.

Приготовьте рабочий раствор A-O-C-M-C two X. Затем соедините 50 микролитров образца и 50 микролитров рабочего раствора в 1,5 миллилитровой пробирке. Далее инкубируйте образцы в течение 20 минут при температуре 50 градусов Цельсия.

Остановите реакцию, добавив 250 микролитров раствора осадка. Затем энергично воздействуйте на каждый образец в течение 10 секунд, чтобы обеспечить полное перемешивание образца с раствором осадка. Затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут и снова подвергните их вихревому движению перед центрифугированием при 1000 G в течение 10 минут.

После этого переведите 200 микролитров SNAT из каждого образца в 96-луночный планшет без помех. Ферментативная активность гранул проявляется в более высоких уровнях солюбилизированного красителя. Измерьте это с помощью абсорбционной спектроскопии на длине волны 590 нанометров.

На этом шаге. Поместите кружочки фильтровальной бумаги в 1,5 или две миллилитровые трубки. Добавьте 100 микролитров 60 миллимолярного ацетата натрия и 100 микролитров образцов в круги фильтровальной бумаги и инкубируйте в течение 20 часов при температуре 50 градусов Цельсия при встряхивании 300 об/мин.

Кроме того, инкубируйте отдельные образцы без фильтровальной бумаги в качестве контроля непосредственно перед проведением анализа. Приготовьте рабочий раствор ПАБК 1,5 х содержащим один миллилитр раствора ПАК А и девять миллилитров раствора ПАБК B.Store на льду до использования. Далее подготовьте образцы в термостабильных пробирках объемом 0,5 миллилитров

Образцы состоят из 45 микролитров воды, пяти микролитров каждого раствора, инкубированного с фильтровальной бумагой, и 100 микролитров рабочего раствора PABA. После этого запустите образцы контроля и пять стандартов, подготовленных таким же образом. Затем инкубируйте образцы, контрольные приборы и стандарты ровно 10 минут при температуре 100 градусов Цельсия и охладите при комнатной температуре еще 10 минут.

Пипеткой 100 микролитров раствора в 96-луночный планшет проводится анализ с помощью спектрофотометра на длине волны 410 нанометров. Вычтите отдельные контрольные значения образца из значений образца фильтровальной бумаги, чтобы определить количество выделяемых редуцирующих сахаров. Вот изображение, показывающее кассеты с экспрессией, а также экспрессию белка в растениях табака.

Вот так проявляется инфильтрированный табачный лист при нормальном освещении и при зеленом свете с красным фильтром, где здесь отчетливо видна экспрессия вишни TR cell 5:00 AM, обозначенная красным цветом. Страница SDS gel, western lot и CMC zy, которые показывают размер и активность Т-клетки 5 A. Общее количество растворимых белков было разделено, и мы можем визуализировать их с помощью окрашивания кумаси синим. Вестерн-блоттинг против области hist-метки Т-клетки 5 A подтверждает размер белка, а также активность целлюлазы против CMC показывает ксенотрансплантат, окрашенный красным конго. Здесь можно увидеть общее количество растворимых белков из листьев растения табака, где TR-клетка 5A временно экспрессировалась до и после термической очистки осаждением, где TR-клетка 5A является самой большой видимой полосой, а также видна в западной партии и на CMC-графике.

Мы также видим общее количество растворимых белков из растений табака, где Tcell 5 A также не было после термического осаждения, и белки из коммерчески доступной смеси трезы целлюлазы. На этом рисунке показано количественное определение активности фермента TR-клетки 5 A TR клетки 5 A инкубировали с четырьмя MUC Azo CMC или фильтровальной бумагой, а деградацию субстрата измеряли путем высвобождения фтор четыре четыре мму азокрасителя или путем количественного определения редуцирующих сахаров от изменения цвета PBA После этой процедуры. Другие методы, такие как нацеливание на белки, могут быть использованы для получения дополнительной информации о том, как локализация белка может влиять на стабильность и активность фермента.

Посмотрев это видео, вы теперь должны иметь четкое представление о том, как временно экспрессировать белки в табаке, а также получить неплохие знания о том, как оценивать ферментативную активность. Преобразование биомассы целлюлозы Foro.