Моделирование Ход у мышей: Постоянный Коагуляция артерии Дистальный средней мозговой
31 июля 2014 г.
Различные мышиные модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) широко используются в экспериментальных исследованиях мозга. Здесь мы демонстрируем модель транскраниальной постоянного дистальной MCAO который производит последовательную корковой инфаркт размером, соответствующим повреждения, введенного большинства ишемических инсультов человека.
Общая цель данной процедуры — создание постоянной окклюзии дистального отдела средней мозговой артерии мыши, в результате чего развивается инфаркт, локализованный преимущественно в коре головного мозга и имеющий размер, сопоставимый с масштабами инсульта у человека. Для этого сначала перед операцией определяется исходный уровень асимметрии использования конечностей. Следующим этапом процедуры является проведение операции по индукции инсульта путем электрокоагуляции дистального отдела средней мозговой артерии.
После операции проверяют наличие очагового сенсомоторного дефицита, оценивая асимметрию использования четырех конечностей. Заключительным этапом является анализ объема инфаркта с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым. В итоге получаемые поражения коры имеют средний размер с небольшим разбросом, что делает данный метод ценной моделью для фундаментальных и трансляционных исследований инсульта.
Основными преимуществами данного метода по сравнению с другими распространенными моделями инсульта являются минимальный уровень смертности, а также объем и локализация инфаркта. Неокортекс задействован при большинстве случаев инсульта у людей, и данные результаты обладают высокой воспроизводимостью. Как правило, исследователи, впервые применяющие этот метод, сталкиваются с определенными трудностями при осторожном удалении черепа с целью минимизации механических повреждений.
Во-вторых, для данной модели критически важными являются правильная идентификация и корректное сопоставление дистальной средней мозговой артерии. Сначала введите анальгетики за 30 минут до начала операции. Включите нагревательный коврик для мыши и установите температуру 37 °C на время проведения операции.
Затем убедитесь, что готов газовый анестетик, состоящий из 70% nitrogen, 30% oxygen и isoflurane. После этого поместите мышь в индукционную камеру с 4% isoflurane до прекращения движений. Затем расположите мышь на греющей подушке и продолжайте подавать isoflurane в концентрации 4% в течение еще одной минуты.
Спустя минуту измените скорость подачи изофлурана на 1,5%. Теперь убедитесь, что мышь достаточно анестезирована, проведя пробу на болевую чувствительность (щипок за палец на лапе), и при подтверждении отсутствия реакции нанесите на глаза этиловый спирт с помощью ножниц. Начните операцию с разреза длиной один сантиметр между ухом и глазом. Отделите кожу и найдите височную мышцу.
Теперь на высокочастотном генераторе установите функцию коагуляции, биполярный режим, мощность 12 watts и подключите пинцет. На подготовительный этап добавьте каплю физиологического раствора на обнаженную височную мышцу. Затем с помощью электрокоагуляционного пинцета отделите височную мышцу от черепа в ее апикальной и дистальной частях.
В результате мы получаем отделенный мышечный лоскут. Теперь найдите среднюю мозговую артерию (MCA) под прозрачным черепом. Она расположена в ростральной части височной области, дорсально по отношению к ретроорбитальному синусу.
С помощью бормашины истончите кость непосредственно над этой артерией до тех пор, пока она не станет прозрачной. В процессе сверления увлажняйте череп физиологическим раствором. Затем, используя очень тонкий пинцет, осторожно удалите кость, чтобы обнажить ветвь MCA.
Установите мощность высокочастотного генератора на 7 Вт. Теперь коагулируйте артерию с помощью электрокоагуляционных щипцов, осторожно прикасаясь к ней, не захватывая ткань. Коагулируйте артерию как проксимальнее, так и дистальнее бифуркации; в случае анатомической особенности при отсутствии бифуркации СМА коагулируйте артерию как можно проксимальнее в двух точках с расстоянием около 1 мм между ними после проведения коагуляции.
Подождите 30 секунд, затем осторожно коснитесь артерии тупоконечными пинцетами. Затем верните мышцу в исходное положение, чтобы она закрывала трепанационное отверстие. Зашейте рану и поместите животное в бокс для послеоперационного ухода при температуре 32 °C для выхода из наркоза, после чего верните его в клетку.
Как правило, животному требуется от 5 до 10 минут для восстановления после наркоза. Тест с цилиндром позволяет определить, предпочитает ли животное использовать одну конечность вместо другой. Поместите животное в прозрачный цилиндр из акрилового стекла, по бокам которого под прямым углом расположены два зеркала.
Записывайте видео с животного в течение пяти минут, располагая камеру напротив вершины двух зеркал на противоположной стороне цилиндра. После каждого испытания протирайте цилиндр и поверхность стола 60% ethanol. Впоследствии проведите покадровый анализ.
Оцените результаты анализа, подсчитав количество касаний одной из четырех лап цилиндра при полном поднятии на задние конечности, а также количество приземлений на одну из четырех конечностей. После оценки полного поднятия, если за одну пробу зафиксировано не менее 20 касаний одной из четырех конечностей, проведите серийный криорезки мозга на срезы толщиной 20 мкм с интервалом 400 мкм. Соберите срезы на предметные стекла для хранения при температуре -20 °C.
Используя данный протокол секционирования, все срезы одного мозга, охватывающие зону инфаркта, можно разместить на одном предметном стекле. Окрасьте срезы с помощью стандартного протокола окрашивания кристаллическим фиолетовым, чтобы определить область инфаркта ткани на каждом срезе мозга. Затем стекла можно закрепить, отсканировать и проанализировать с использованием метода Свонсона для оценки отека.
Скорректированная летальность вследствие операции по окклюзии СМА составила менее 5%, главным образом из-за субарахноидального кровоизлияния или неправильного проведения анестезии. В течение периода наблюдения летальных исходов не наблюдалось. Для данного анализа использования PA измеряли асимметрию с помощью цилиндрического теста после индукции инсульта и сравнивали её с базовыми значениями, полученными до окклюзии СМА; значительная асимметрия конечностей была выявлена через 24 часа, которая частично восстановилась в течение первой недели после инсульта, спустя неделю после инсульта.
Индукция инфаркта в данной модели с окрашиванием кристаллическим фиолетовым выявила средний объем инфаркта 15,4 cubic millimeters, что составляет примерно 12% одного полушария головного мозга. Стандартное отклонение данной модели очень низкое. Кроме того, локализация инфаркта имела минимальную вариабельность.
При правильном выполнении эта операция занимает не более 10 минут. Помимо продемонстрированных тестов с цилиндром и окрашивания кристаллическим фиолетовым, для дальнейшей характеристики результатов и решения конкретных исследовательских задач могут быть использованы другие общепринятые поведенческие тесты и гистологические методы. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как проводить постоянную окклюзию дистального отдела средней мозговой артерии (MCA) у мышей.
Мы настоятельно рекомендуем использовать стандартные операционные процедуры и подробную документацию для обеспечения воспроизводимости метода.
Обзор
В данной статье представлен метод проведения постоянной окклюзии дистальной части средней мозговой артерии (MCAO) у мышей, которая приводит к стабильному инфаркту коры головного мозга, схожему с ишемическим инсультом у человека. Данная методика представляет ценность как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований инсульта благодаря своей воспроизводимости и низкому уровню смертности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования инсульта
- Модели на животных
Теоретические основы
- Окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) является распространенной моделью для изучения ишемического инсульта.
- Данная модель позволяет исследовать инфаркт коры головного мозга в контролируемой среде.
- Понимание механизмов инсульта у мышей может дать сведения, применимые к заболеваниям человека.
- Воспроизводимость и низкий уровень смертности повышают ценность данной модели для исследований.
Цель исследования
- Продемонстрировать надежный метод индуцирования стойкой окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) у мышей.
- Оценить размер возникшего инфаркта коры головного мозга и его соответствие инсультам у людей.
- Оценить поведенческие результаты после операции с помощью тестов на асимметрию использования конечностей.
Используемые методы
- Оценка исходной асимметрии использования конечностей перед операцией.
- Электрокоагуляция дистального отдела средней мозговой артерии для индукции инсульта.
- Послеоперационная оценка сенсомоторного дефицита с помощью цилиндрического теста.
- Анализ объема инфаркта путем окрашивания срезов мозга кристаллическим фиолетовым.
Основные результаты
- Средний объем инфаркта составил 15,4 кубических миллиметра, что соответствует примерно 12% одного полушария мозга.
- Значительная асимметрия конечностей была выявлена через 24 часа после операции, при этом частичное восстановление наблюдалось в течение следующей недели.
- Модель продемонстрировала низкую вариабельность локализации и размера инфаркта.
- Летальность вследствие процедуры составила менее 5%, в основном из-за субарахноидальных кровоизлияний или ошибок при проведении анестезии.
Выводы
- Описанный метод MCAO эффективен для изучения ишемического инсульта у мышей.
- Он обеспечивает воспроизводимую модель с минимальной смертностью и стабильными результатами.
- Поведенческие тесты и гистологический анализ позволяют дополнительно охарактеризовать последствия инсульта.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данная модель обеспечивает воспроизводимое инфарктное поражение коры головного мозга у мышей с низким уровнем смертности, что способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней для терапии инсульта. Размер и локализация инфаркта соответствуют патологии инсульта у человека, что повышает трансляционную значимость для доклинической оценки терапевтических средств. Поведенческие и гистологические показатели обеспечивают количественные конечные точки для принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на ранних этапах разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в путях коркового инсульта, обладающих высокой анатомической релевантностью заболевания человека.
- Практическая ценность: низкая вариабельность объема и локализации инфаркта повышает достоверность оценки воздействия на мишени и модуляции путей.
- Прогностическая ценность: способствует доклиническому отбору путем моделирования отсроченных патофизиологических механизмов, таких как воспаление, ангиогенез и нейронная пластичность.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Обеспечивает создание стандартизированных поражений коры головного мозга, пригодных для последовательного скрининга соединений и оценки зависимости «доза — ответ».
- Количественные показатели: Измерение объема инфаркта с помощью окрашивания крезиловым фиолетовым позволяет проводить объективный гистоморфометрический анализ эффектов терапии.
- Масштабируемость: Хирургическая процедура занимает менее 10 минут при минимальной смертности, что способствует повышению пропускной способности в процессах поиска новых лекарств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Преобладание кортикальных инфарктов соответствует картине большинства ишемических инсультов у людей, что повышает прогностическую достоверность при трансляции результатов в клинику.
- Механистическая непрерывность: Облегчает изучение путей развития подострого и хронического инсульта, включая регенерацию и пластичность, в течение длительных окон наблюдения.
- Оптимизация рисков при разработке: Низкая смертность и высокая воспроизводимость снижают биологическую вариабельность, позволяя проводить более надежную доклиническую оценку эффективности и безопасности.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум разработки методов лечения инсульта — от валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинических испытаний эффективности, особенно для терапии, направленной на механизмы повреждения и восстановления коры головного мозга.
- Поисковая биология: Обеспечивает проверку гипотез относительно нейропротекторных и нейрорегенеративных соединений на клинически значимой модели инфаркта.
- Скрининг: Позволяет стандартизировать создание инфаркта для последовательной оценки влияния соединений на прогрессирование повреждения.
- Аналитика: Окрашивание крезиловым фиолетовым и тест с цилиндром обеспечивают взаимодополняющие гистологические и функциональные показатели для анализа зависимости «доза-эффект» и временной динамики.
- Трансляционные исследования: Моделируют отсроченные патофизиологические процессы, характерные для окон терапевтического вмешательства при подостром и хроническом инсульте.
- Корпоративное повторное использование: Стандартизированные хирургические и аналитические процедуры обеспечивают воспроизводимость между проектами и возможность совместного использования платформы различными нейробиологическими группами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Высокая анатомическая и патофизиологическая близость к инсульту у человека повышает уверенность в валидации мишеней.
- Операционная ценность: Минимальная смертность и низкая вариабельность инфаркта повышают воспроизводимость анализа и сокращают количество животных, используемых в каждом эксперименте.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более раннюю идентификацию биологически активных соединений, снижая риск неудач на поздних стадиях программ по лечению инсульта.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию мишеней на основе данных о стабильном модулировании размера инфаркта и функционального восстановления.
Особенности реализации
- Требуется опыт применения микрохирургических методов и навыков идентификации внутричерепных сосудов.
- Результат зависит от оборудования для электрокоагуляции и точности настроек мощности для окклюзии артерий.
- Необходимы стандартизированные протоколы анестезии и послеоперационного ухода для минимизации вариабельности.
- Адаптация метода для трансгенных моделей требует подтверждения технической возможности проведения операции и однородности инфарктов.
- Гистологический анализ требует стандартизированных протоколов нарезки и окрашивания срезов для достоверного количественного определения объема инфаркта.
