Фокус Образование: клеточном анализе для определения онкогенных потенциал гена

Общая цель этой процедуры заключается в проведении анализа образования очага в клеточных линиях фибробластов мыши с использованием ретровируса для определения онкогенного потенциала гена. Это достигается путем предварительного клонирования последовательности интересующего гена в ретровирусный вектор. Второй шаг заключается в получении ретровирусных частиц с использованием вирусного вектора и упаковочных клеток PLA e.

Затем ретровирус используется для инфицирования клеток фибробластов NIH трех Т-трех мышей с целью оценки трансформирующего потенциала интересующего гена. Последний шаг заключается в том, чтобы позволить трем Т-3 клеткам NIH делиться в течение двух-трех недель, после чего следует окрашивание кристаллическим фиолетовым цветом для количественной оценки количества образовавшихся очагов. В конечном счете, анализ формирования фокуса используется для того, чтобы показать, достаточна ли сверхэкспрессия интересующего гена для индуцирования независимого роста плотности в клетках фибробластов мыши.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии рака, такие как скрининг онкогенного потенциала гена. Для начала сделайте вирусный вектор так, как описано в текстовом протоколе. Затем создайте культуры Plat E из замороженных клеток путем быстрого размораживания клеток Plat E на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, а затем переложите в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Медленно добавьте девять миллилитров среды PLA E в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 180-кратном G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки 10 миллилитрами среды плат Е и переложите в 10-сантиметровую чашку для культивирования.

Затем инкубируйте клетки в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока их конфлюентность не составит от 80 до 90%. Выполните расщепление клеток, сначала аспирировав среду, затем промойте клетки один раз PBS, затем добавьте два миллилитра 0,05% трипцина ЭДТА и инкубируйте в течение одной минуты при комнатной температуре, отделите клетки постукиванием пальцами. Затем добавьте 10 миллилитров среды плат Е и переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте пробирку, как и раньше, и ресуспендируйте клетки 10 миллилитрами среды типа Plat E. Далее посев, 2 миллиона клеток на 10-сантиметровую чашку для культивирования используют среду Plat E без каких-либо антибиотиков и оставляют клетки инкубироваться на ночь. На следующий день перелейте 300 микролитров оптимума в микропробирку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте в подготовленную пробирку с Optum 27 микролитров полиэтиленамина. Аккуратно перемешайте постукиванием пальцами и выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте девять микрограммов плазмидной ДНК трансфекционного класса в пробирку, аккуратно перемешайте вортексированием и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте смесь по каплям в чашку E перед инкубацией в течение ночи. На следующий день аспирируйте среду, содержащую реагент для трансфекции, и добавьте 10 миллилитров свежей среды Plat E перед возвращением клеток в инкубатор для создания трех культур T-3. Сначала быстро разморозьте клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и переложите в пробирку объемом 15 миллилитров.

Медленно добавьте девять миллилитров среды NIH 3, T 3 в клетки, центрифугируйте пробирку при 180 G в течение пяти минут и выбросьте жидкость. Затем повторно суспендируйте клетки 10 миллилитрами среды NIH три, T 3 и переложите в 10-сантиметровую чашку для культивирования. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия, поддерживая их в состоянии слияния по мере увеличения частоты спонтанной трансформации.

Как только культура достигает равномерной бегучести, выращенное семя трижды по 10 до пятого nih, три Т-три клетки на 10-сантиметровую чашку и инкубируют в течение ночи для заражения на следующий день. На следующий день соберите ретровирусную надосадочную жидкость из чашки Plat E с помощью одноразового шприца объемом 10 миллилитров, профильтруйте его через нейлоновый мембранный фильтр размером 0,45 микрона и переложите в 15-миллилитровую трубку. Добавьте в клетки 10 миллилитров свежей среды Plat E перед тем, как вернуть их в инкубатор.

Затем отсасывайте среду из инфицируемой чашки NIH с тремя Т-тремя клетками и добавьте пять миллилитров обычной среды NI H-3, Т-3 и пять миллилитров вирус-содержащей фильтрованной надосадочной жидкости. Далее добавьте в блюдо полимозг. Добавьте концентрацию шесть микрограмм на миллилитр.

Инкубируйте клетки в течение ночи, прежде чем повторять этапы заражения для второго раунда инфекции. После заражения замените вирус, содержите среду с обычной IH три T три среды. Дайте IH трем Т-трем клеткам расти в течение двух-трех клеток, заменяя среду по мере необходимости для окрашивания кристаллами фиолетового цвета.

Отсадите NIH три Т три средних и поставьте посуду на лед. Дважды вымойте посуду с ледяным ПБС. Зафиксируйте ячейки ледяным метанолом на 10 минут.

Затем снимите посуду со льда и отсадите метанол. Добавьте три миллилитра 0,5% кристаллического фиолетового раствора, полученного на 25% метаноле и выдержите посуду в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации аспирируйте кристаллический фиолетовый раствор и тщательно промойте чашку водой Milli Q, пока при ополаскивании не исчезнет цвет.

Дайте посуде высохнуть в незакрытом виде в течение ночи на столешнице. Как только посуда высохнет, с помощью линейки измерьте очаги и пересчитайте те, которые больше пяти миллиметров в диаметре. Число MXD three является основным фактором транскрипции спиральной петли helix leucine zipper, который является нетипичным членом семейства MAD и, как сообщается, участвует в канцерогенезе по сравнению с отрицательным контролем и положительным контролем.

Чашки NIH three T three, в которых MXD three была сверхэкспрессирована, имели значительно меньше фокусов. Данные были собраны в ходе нескольких экспериментов для определения значимости, и в этом анализе наблюдались те же тенденции. Результаты свидетельствуют о том, что MXD 3 не функционирует как онкоген После этой процедуры.

Другие методы, такие как анализ формирования фокуса с комбинациями генов, рост пролиферации мягкого оука и анализ клеточного цикла, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы.