Квартира Гора Визуализация кожу мыши и его применение к анализу Волосяной фолликул паттерна и сенсорной Axon морфологии

Кожа млекопитающих содержит разнообразные структур - таких как волосяных фолликулов и нервных окончаний - которые отличаются определенным закономерности пространственной организации. Анализируя кожу в виде плоской горе использует в своих интересах 2-мерной геометрии этой ткани для производства полной толщины изображения с высоким разрешением структур кожи.

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации структур кожи, таких как волосяные фолликулы и нервные окончания, во всей их полноте без физического разреза образца. Это достигается путем предварительного сбора кожи с различных частей тела, включая заднюю заднюю лапу и хвост. Второй шаг – расплющивание и очистка образцов кожи.

Далее образцы кожи подвергаются подходящей фиксации. Заключительным этапом является проведение иммунохимического окрашивания или биохимического анализа образцов кожи. В конечном счете, визуализация с помощью препарирующего или конфокального микроскопа используется для визуализации геометрии различных структур кожи.

Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как подготовка эпидермального гормонального фона, заключается в том, что его можно наносить на кожу в любом месте тела и он не требует отделения эпидермиса от дермы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении полярности подошвенных клеток. Поскольку двумерная геометрия кожи и странное расположение волосяных фолликулов делают кожу идеальной системой для изучения этого процесса, этот метод может не только дать представление о полярности растительных клеток, но и быть применен для изучения других аспектов развития кожи, таких как определение типов соматосенсорных нейронов на основе прямой визуализации отдельных актов на верхних морфологиях.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку рассечение кожи в некоторых областях, таких как ноги и хвост, трудно освоить, важно идеально разгладить их и избежать морщин и перерастяжения. В этой демонстрации будет собрана спинная кожа у трех мышей, усыпленных изофтором. При ингаляции с помощью лезвий делается горизонтальный разрез от основания хвоста вдоль каждого фланга, проходя по тыльной стороне основания каждой конечности, идущей сбоку к ушам и заканчивающейся у носа.

Аккуратно отшелушивает кожу от подлежащих тканей, двигаясь сзади вперед путем удержания кожи между пальцами в перчатках, чтобы она не была защемлена щипцами. При очистке кожи на уровне ушей сначала отрежьте уши ножницами и действуйте особенно медленно, так как кожа может порваться в этом месте. Начиная с этого момента, ориентируйте кожу внутренней стороной вверх.

Прикрепите кожу к S Guard с помощью примерно 20 булавок от насекомых, равномерно расположенных по периферии. Не перенатягивайте кожу. Нанесите на кожу от 10 до 20 миллилитров PBS с помощью угловых или изогнутых щипцов.

Удалите кожный жир и соединительную ткань. Смотрите заостренным концом щипцов горизонтально, чтобы свести к минимуму риск того, что щипцы проникнут в кожу. Выдавите все пузырьки воздуха, которые попали под кожу, осторожно проведя аппликатором с ватным наконечником по поверхности кожи.

Следующим этапом является фиксация шкурки булавки. Если кожа будет использоваться для визуализации меланина или гистохимии щелочной фосфатазы, добавьте 20 миллилитров на 10-сантиметровую сигарную тарелку свежеприготовленного 4% P-F-A-P-B-S или 10% буферизованного формина. Если кожа будет использоваться для иммуноокрашивания или визуализации трансгенного кератина, KRT 17 GFP добавить 20 миллилитров на 10-сантиметровую согарную пластину свежеприготовленного 2%P-F-A-P-B-S аккуратно перевернуть на ночь в холодном помещении на следующий день, умыться в PBS более 10 минут.

Процедура гистохимии щелочной фосфатазы не будет показана в этом видео. Для визуализации меланина обезвоживайте кожу с помощью градуированной серии этанола в один день для каждого шага с мягким горизонтальным вращением при комнатной температуре. Через три дня удалите остатки соединительных тканей с обезвоженной кожи с помощью 100% этанола.

Удалите булавки от насекомых и переложите кожу в стеклянную посуду диаметром 10 сантиметров. Для успеха этой процедуры образец кожи должен быть собран как неповрежденный кусок и идеально расплющен. Поместите на кожу два предметных стекла микроскопа, чтобы сделать ее сплющенной и предотвратить скручивание.

Добавьте 20 миллилитров бензоилабензоата и бензоилового спирта или ВВБ, которые быстро затвердеют в ткани в течение следующих нескольких часов. Снимите слайды с кожи на несколько секунд, чтобы BBBA смылся по коже. Кожа стопы для анализа рисунка волосяных фолликулов обычно препарируется от P 1 до P 8 у животных После эвтаназии отрезают ступни выше голеностопного сустава и делают один прямой разрез вдоль вентральной поверхности через подошвы ног.

Аккуратно отшелушите кожу от подлежащих тканей, двигаясь в проксимальном и дистальном направлении. Отрежьте пальцы, чтобы освободить кожуру, и прикрепите кожу к нагару внутренней поверхностью вверх. Соединительная ткань на стопе минимальна.

Кожа трансгенная. Кожа KRT 17 GFP теперь готова к визуализации с использованием меланина. Зафиксируйте и обработайте кожу так, как было показано ранее для кожи спинного канала После эвтаназии животного P 21 удалите шерсть, втирая средство для удаления волос.

Нанесите гель на поверхность кожи пальцем и большим пальцем в перчатке и подождите 10 минут. Промойте поверхность кожи водой из-под крана. Затем рассеките и приколите кожу стопы к S-образной защите, как показано ранее.

Зафиксируйте с помощью 1%P-F-A-P-B-S в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем постирайте в PBS. Чтобы подготовить кожу хвоста, сделайте круговой надрез вокруг основания хвоста, а затем продольный разрез, который проходит по всей длине хвоста вдоль его брюшной грани. Снимите кожу хвоста, начиная с кончика, крепко взявшись за кончик копчика и/или соединительной ткани одной парой щипцов, а кожу — с помощью второй пары щипцов.

Прикрепите кожу хвоста к защитному кожуху SIL для анализа распределения меланина и ориентации волосяных фолликулов. Фиксируйте и обрабатывайте кожу, как показано на примере кожи тыльной стороны, для анализа сальных желез перед фиксацией. Разрежьте кожу хвоста на ряд сегментов длиной от 0,5 до одного сантиметра и инкубируйте кусочки кожи в PBS с пятью миллимолярами ЭДТА в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

Чтобы ослабить адгезию эпидермиса на следующий день, аккуратно отшелушите эпидермис от дермы. Закрепите на границе эпидермиса до S защиты и зафиксируйте в 4% P-F-A-P-B-S на один час при комнатной температуре. Впоследствии промойте эпидермис PBS и покрасьте маслом красного цвета О, как описано в тексте протокола.

Препарирующий микроскоп используется для визуализации кожи спинной ноги или хвоста, которая погружена в BBBA, сплющенную под стеклянным предметным стеклом и все еще находящуюся в стеклянной чашке. Такой подход сводит к минимуму загрязнение микроскопа ГББК. Освещайте тарелку снизу, чтобы свести к минимуму пространственные колебания интенсивности света в поле зрения.

Поднимите стеклянную чашку на высоту около 10 сантиметров над стандартной рабочей поверхностью препарирующего микроскопа и поместите рассеивающую пластиковую или стеклянную пластину над источником света. Когда визуализация будет завершена, верните кожу к 100% этанолу для длительного хранения при температуре минус 20 градусов Цельсия. Чтобы подготовить окрашенную щелочной фосфатазой кожу к визуализации, поместите ее между двумя стеклянными пластинами по типу, используемому для небольших белковых гелей.

Будьте осторожны, избегайте попадания пузырьков воздуха между пластинами и кожей. Тщательно смойте излишки BBBA бумажным полотенцем. Поместите этот сэндвич из пластинчатой скин-пластины на предметный столик для микроскопа.

Используйте светлопольное или сетевое освещение с объективом 10 x и шагом по оси Z на два микрометра или пять микрометров. Используйте механизированную сцену XY для захвата монтажа изображений XY, которые сшиты вместе для создания единого трехмерного набора данных в оттенках серого. Выполняйте полуавтоматическую трассировку оправок аксонов с помощью любого из множества программных пакетов.

Светлопольная визуализация плоских участков кожи может быть использована для получения изображения одного кожного сенсорного выступа, показанного здесь, с его трассировкой. Визуализация в светлом поле также позволяет визуализировать узоры волосяных фолликулов на основе пигментации меланина. На этих изображениях показана кожа P one от шести нокаутных мышей типа Wild и frizzled six, а кожа P seven от шести нокаутированных мышей Frizzled.

Световая микроскопия плоских креплений кожи может быть использована для определения геометрии сальных желез и хвостов. Кожа, визуализированная с помощью масла, красные O сальные железы дезорганизованы у вьющейся мыши с шестью нокаутами по сравнению с спинной лапой дикого типа. Кожа, собранная у дикого типа, и вьющаяся кожа шести нокаутированных мышей, несущих A GFP, помечена кератином KRT 17 GFP и окрашена маслом.

Ред О показал, что в центре нокаутирующего скина есть волосяной вихрь. Конфокальная визуализация плоской кожи также может определить геометрию волосяных фолликулов, визуализированных с помощью KRT 17 GFP и анти-GFP иммуноокрашивающих и эректорных таблеток. Глазные мышцы визуализируются с помощью иммуноокрашивания анти-сму-мышц актином.

Кластеры клеток Меркеля визуализируются с помощью антицитокератина восемь или с помощью поглощения красителя am 1 43, а его центральный волосяной фолликул визуализируется с помощью KRT 17 GFP Вместо того, чтобы быть открытыми по направлению к передней части, кластер клеток Меркеля с нокаутом Frizzled six образует замкнутый круг После освоения диссекция может быть выполнена примерно за 30 минут, если она выполнена правильно, а различные положения могут быть выполнены в течение нескольких дней или недели. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно собирать кожу с различных участков тела и как стоять на них, чтобы визуализировать разные структуры кожи в гормональном формате. Изображения структур кожи полной толщины и высокого разрешения могут быть получены с помощью стандартной микроскопии в высоком освещении и конфокальной микроскопии.

Не забывайте, что работа с параформным альдегидом и ВББ может быть крайне опасной. Вдыхание паров должно быть сведено к минимуму, если эти растворы хранятся в закрытых контейнерах, а также следует избегать контакта с кожей. Не допускайте контакта BBBA с пластиком.