Квартира Гора Визуализация кожу мыши и его применение к анализу Волосяной фолликул паттерна и сенсорной Axon морфологии

Общая цель данной процедуры — визуализация структур кожи, таких как волосяные фолликулы и нервные окончания, в их целостности без физического секционирования образца. Для этого сначала осуществляется сбор кожи с различных областей тела, включая тыльную сторону задней лапы и хвост. Вторым этапом является расправление и очистка образцов кожи.

Затем образцы кожи подвергают соответствующей фиксации. Заключительным этапом является проведение иммуноокрашивания или гистохимического анализа образцов кожи. В итоге для визуализации геометрии различных структур кожи используется микроскопия с помощью диссекционного или конфокального микроскопа.

Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как приготовление препарата эпидермального гормонального среза, является возможность ее применения к коже в любом месте тела, а также отсутствие необходимости отделения эпидермиса от дермы. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов при изучении полярности планарных клеток. Поскольку двумерная геометрия кожи и специфическое расположение волосяных фолликулов делают кожу идеальной системой для изучения этого процесса, данный метод позволяет не только получить представление о полярности планарных клеток, но и может быть применен для изучения других аспектов развития кожи, таких как определение типов соматосенсорных нейронов на основе прямой визуализации отдельных аксонов по их верхней морфологии.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку препарирование кожи в некоторых областях, таких как стопы и хвост, освоить довольно сложно; важно идеально расправить кожу, избегая образования складок и чрезмерного растяжения. В данной демонстрации будет произведен сбор кожи спины трех мышей, усыпленных изофлураном путем ингаляции. Используйте лезвия, чтобы сделать горизонтальный разрез от основания хвоста вдоль каждого бока, проходя по дорсальной стороне основания каждой конечности, далее латерально от ушей и заканчивая разрезе у носа.

Осторожно отделите кожу от подлежащих тканей, двигаясь от задней части к передней, удерживая кожу пальцами в перчатках, чтобы она не была зажата пинцетом. При отделении кожи в области ушей сначала отсеките уши ножницами и действуйте особенно медленно, так как в этом месте кожа может разорваться. После этого ориентируйте кожу внутренней стороной вверх.

Закрепите кожу на S Guard примерно 20 энтомологическими булавками, равномерно распределенными по периферии. Не перетягивайте кожу. Покройте кожу от 10 до 20 миллилитров PBS, используя угловой или изогнутый пинцет.

Иссеките кожу вместе с прилегающей жировой и соединительной тканью. Держите острый конец пинцета горизонтально, чтобы минимизировать риск прокола кожи. Удалите все пузырьки воздуха, попавшие под кожу, аккуратно прокатывая по ее поверхности ватный тампон.

Следующим этапом является фиксация кожи подушечек пальцев. Если кожа будет использоваться для визуализации меланина или гистохимического анализа на щелочную фосфатазу, добавьте 20 миллилитров на одну 10-сантиметровую чашку Петри свежеприготовленного 4% PFA в PBS или 10% буферизированного формалина. Если кожа будет использоваться для иммуноокрашивания или визуализации трансгенного кератина KRT 17 GFP, добавьте 20 миллилитров на одну 10-сантиметровую чашку Петри свежеприготовленного 2% PFA в PBS; аккуратно перемешивайте в течение ночи в холодильной комнате, а на следующий день промойте в PBS более 10 минут.

Процедура гистохимии щелочной фосфатазы в данном видео не демонстрируется. Для визуализации меланина проведите дегидратацию кожи с использованием серии растворов этанола возрастающей концентрации, выдерживая образец на каждом этапе по одному дню при осторожном горизонтальном вращении при комнатной температуре. Через три дня удалите остатки соединительных тканей с дегидратированной кожи, находящейся в 100% ethanol.

Удалите энтомологические булавки и перенесите кожу в стеклянную чашку диаметром 10 сантиметров. Для успешного проведения данной процедуры образец кожи должен быть собран в виде целого фрагмента и полностью расправлен. Положите на кожу два стеклянных предметных стекла, чтобы расправить её и предотвратить сворачивание.

Добавьте 20 миллилитров бензоилбензоата и бензилового спирта (BBBA), который обеспечит быстрое отверждение ткани в течение следующих нескольких часов. Приподнимите предметные стекла над кожей на несколько секунд, чтобы раствор BBBA омыл поверхность кожи. Кожу стоп для анализа расположения волосяных фолликулов обычно выделяют у животных от P1 до P8. После эвтаназии ампутируйте стопы выше голеностопного сустава и сделайте один прямой разрез вдоль вентральной поверхности через подошвы стоп.

Осторожно отделите кожу от подлежащих тканей, двигаясь в проксимальном направлении к дистальному. Перережьте пальцы, чтобы полностью освободить кожу, и закрепите ее булавками на подложке внутренним слоем вверх. На стопе наблюдается минимальное количество соединительной ткани.

Трансгенная кожа. Кожа KRT 17 GFP готова к визуализации меланина. Зафиксируйте и обработайте кожу, как было продемонстрировано ранее для кожи спины. После эвтаназии животного в возрасте P 21 удалите шерсть с помощью средства для депиляции.

Нанесите гель на поверхность кожи, используя большой и указательный пальцы в перчатках, и подождите 10 минут. Промойте поверхность кожи проточной водой. Затем проведите диссекцию и закрепите кожу стопы булавками на S-образной подложке, как показано ранее.

Фиксируйте в 1%P-F-A-P-B-S в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего промойте в PBS. Для подготовки кожи хвоста сделайте круговой разрез вокруг основания хвоста, а затем продольный разрез по всей длине хвоста вдоль вентральной стороны. Снимите кожу с хвоста, начиная с кончика: крепко зажмите кончик хвостового позвонка или соединительную ткань одним пинцетом, а кожу — вторым.

Закрепите кожу хвоста на подложке SIL для анализа распределения меланина и ориентации волосяных фолликулов. Зафиксируйте и обработайте кожу, как показано для кожи спины при анализе сальных желез перед фиксацией. Разрежьте кожу хвоста на серию сегментов длиной примерно 0,5–1 см и инкубируйте фрагменты кожи в PBS с 5 мМ EDTA в течение ночи при 37 °C.

Чтобы ослабить адгезию эпидермиса к дерме на следующий день, аккуратно отделите эпидермис от дермы. Прикрепите интерфейс эпидермиса к S-образной опоре и зафиксируйте в 4%P-F-A-P-B-S в течение одного часа при комнатной температуре. Впоследствии промойте эпидермис буфером PBS и окрасьте Oil Red O, как описано в тексте протокола.

Стереомикроскоп используется для получения изображений кожи спинной части стопы или хвоста, которые погружены в BBBA, прижаты стеклянным предметным стеклом и остаются в чашке. Такой подход сводит к минимуму загрязнение микроскопа BBBA. Освещайте чашку снизу, чтобы минимизировать пространственные вариации интенсивности света по всему полю зрения.

Поднимите стеклянную чашку примерно на 10 сантиметров над стандартной рабочей поверхностью диссекционного микроскопа и поместите диффузионную пластиковую или стеклянную пластину над источником света. После завершения визуализации верните кожу в 100% ethanol для длительного хранения при температуре минус 20 градусов Цельсия. Чтобы подготовить кожу, окрашенную на щелочную фосфатазу, к визуализации, поместите ее между двумя стеклянными пластинами того типа, который используется для малых белковых гелей.

Следите за тем, чтобы между пластинами и кожей не образовались пузырьки воздуха. Осторожно удалите излишки BBBA бумажным полотенцем. Поместите этот «сэндвич» из пластин и кожи на предметный столик микроскопа.

Используйте освещение в светлом поле или дифференциально-интерференционный контраст (DIC) с объективом 10x и шагом по оси Z в 2 мкм или 5 мкм. Используйте механизированный предметный столик XY для получения серии XY-изображений, которые затем объединяются («сшиваются») в единый трехмерный набор данных в градациях серого. Выполните полуавтоматическое прослеживание арборов аксонов с помощью любого из доступных программных пакетов.

Метод светлого поля при визуализации распластанных препаратов кожи может быть использован для получения изображений отдельного кожного сенсорного дерева, представленного здесь вместе с его прослеженным контуром. Визуализация в светлом поле также позволяет определить структуру волосяных фолликулов по меланиновой пигментации. На данных изображениях представлена кожа P1 мышей дикого типа и мышей с нокаутом Frizzled 6, а также кожа P7 мышей с нокаутом Frizzled 6.

Световая микроскопия препаратов кожи в виде плоских маунтов может быть использована для определения геометрии сальных желез и их протоков. При визуализации кожи с помощью Oil Red O сальные железы у мышей с нокаутом гена frizzled 6 дезорганизованы по сравнению с кожей тыльной стороны стопы мыши дикого типа. Кожа, полученная от мышей дикого типа и мышей с нокаутом frizzled 6, экспрессирующих кератин KRT 17, меченный GFP (KRT 17 GFP), и окрашенная Oil Red O.

Окрашивание Red O показало, что кожа нокаутного эмбриона имеет волосяной вихрь в центре. Конфокальная визуализация плоскостных препаратов кожи также позволяет определить геометрию волосяных фолликулов, визуализированных с помощью KRT 17 GFP и иммуноокрашивания anti GFP, а также мышц-эректоров. Глазодвигательные мышцы были визуализированы с помощью иммуноокрашивания anti smoo muscle actin.

Скопления клеток Меркеля визуализируют с помощью антител к цитокератину 8 или путем поглощения красителя AM 1:43, а центральный волосяной фолликул — с помощью KRT 17 GFP. В отличие от дикого типа, где скопления открыты к передней части, скопления клеток Меркеля у нокаутных по Frizzled 6 образуют замкнутый круг. После освоения методики правильно проведенное препарирование занимает около 30 минут, а подготовка различных срезов может быть выполнена в течение нескольких дней или недели. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как собирать образцы кожи из различных областей тела и как их окрашивать для визуализации различных структур кожи в горизонтальном сечении. Полнослойные изображения структур кожи с высоким разрешением могут быть получены с помощью стандартной световой и конфокальной микроскопии.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом и BBBA может быть чрезвычайно опасной. Необходимо свести к минимуму вдыхание паров, храня эти растворы в закрытых контейнерах, и избегать контакта с кожей. Не допускайте контакта BBBA с пластиком.