Нанозолото Маркировка из дрожжей эндосомных системы для Ультраструктурные Анализы

Общая цель следующего эксперимента заключается в визуализации на ультраструктурном уровне эндосомальных компартментов дрожжей Saccharomyces cei. Это достигается путем приготовления сферопластов дрожжей, которые затем подвергаются эндоцитозному поглощению положительно заряженных наночастиц золота. На втором этапе образец фиксируют и подвергают секционированию для получения ультратонких криосрезов клеток.

Затем криосрезы подвергают реакции усиления серебром. Для увеличения и визуализации эндоцитозировавших положительно заряженных наночастиц золота получают результаты, демонстрирующие морфологию различных эндосомальных компартментов дрожжей на основе специфического маркирования в рамках данной процедуры. Основным преимуществом этого метода по сравнению с нашими существующими методами, такими как иммунозолотое маркирование срезов, является то, что он не зависит от антител, которые зачастую не работают при подготовке препаратов для электронной микроскопии.

Хотя данный метод позволяет получить представление о лизосомальной системе дрожжей sarchi ESIS vei, он также может быть применен к другим эукариотическим моделям, таким как другие виды дрожжей и клетки млекопитающих. Дрожжи, из которых будут получены сферопласты, сначала инкубируют в течение ночи при 30 °C в 10 мл соответствующей среды, выбранной в зависимости от дизайна эксперимента на следующий день. После измерения оптической плотности культуры при 600 нм разведите клетки в той же культуральной среде до значения OD 600 от 0.2 до 0.4.

Культивируйте клетки до экспоненциальной фазы роста при OD 600 от одного до двух, перенесите эквивалент клеток OD 600, равный 10, в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 2100 ×g в течение пяти минут. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в пяти мл 100 мМ PIPES и 10 мМ DTT при pH 8,0, затем инкубируйте при 30 °C в течение 10 минут. Соберите клетки путем центрифугирования.

После удаления супернатанта ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах среды, содержащей 1 M сорбитола и 5 мг литического фермента. Инкубируйте смесь при 30 °C при осторожном перемешивании в течение 30 минут. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 ×g в течение пяти минут для сбора осадка, который соответствует сферопластам.

Удалите супернатант и повторно суспендируйте сферопласты в 960 µL ледяной среды, содержащей 1 M сорбитола. Перенесите смесь в охлажденную на льду микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Для начала процедуры поглощения наночастиц золота с помощью пипетки аккуратно смешайте сферопласты с положительно заряженными наночастицами золота.

Ресуспендируйте в 40 µL воды. Конечный объем смеси должен составлять 1 mL. Поместите полученную клеточную суспензию на лед на 15 минут.

Перенесите суспензию при комнатной температуре и инкубируйте в течение необходимого времени для интернализации нанозолота путем эндоцитоза. По завершении требуемого поглощения нанозолота остановите реакцию, добавив в суспензию клеток один миллилитр фиксатора двойной концентрации, содержащего 1 M сорбитола. Выдержите пробирку при комнатной температуре в течение 30 минут.

В течение 30 минут осторожно несколько раз переверните микроцентрифужную пробирку вручную, чтобы поддерживать PHE plast и суспензию в однородном состоянии. Затем дважды центрифугируйте при 1700 Gs в течение 25 секунд, удалите супернатант и добавьте 1 мл свежего фиксатора стандартной концентрации, содержащего 1 М сорбитола; инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре на медленно вращающемся колесе. После этого клетки подвергают обработке и криорезке, как описано в текстовом протоколе перед началом данной процедуры. Извлеките набор для усиления серебрения из морозильной камеры и разморозьте в инкубаторе при 37 °C. Поместите размороженный набор в настольный инкубатор при 24 °C, предварительно установленный в темной комнате, до начала использования.

Поместите нагревательную плитку в темное помещение и разогрейте ее до конечной температуры 24 °C. Накройте верхнюю часть нагревательной плитки защитным покрытием для лабораторного стола глянцевой стороной вверх и закрепите его лентой. Наложите парафильм на защитное покрытие и отметьте края черным маркером, чтобы их было видно в темноте.

Прикрепите термометр скотчем к верхней части защитного покрытия поверхности. Чтобы контролировать температуру нагревательной плиты, постепенно регулируйте температурный режим. Если температура не составляет 24 °C, поместите на плиту пробирку объемом 50 мл с дважды дистиллированной водой.

Внутри инкубатора наполните небольшую чашку Петри дважды дистиллированной водой, предварительно нагретой до 37 °C. Поместите две никелевые сеточки с криосрезами в воду образцом вниз на 30 минут. По истечении 30 минут наполните вторую чашку Петри предварительно нагретой дважды дистиллированной водой и поместите те же две никелевые сеточки в воду еще на 30 минут.

Снова промойте сеточки, проводя их стороной с образцом по нескольким каплям дважды дистиллированной воды при 24 °C, помещенным на предметное стекло, зафиксированное на нагревательной плитке. Убедитесь, что на предметном стекле готовы еще девять капель дважды дистиллированной воды для промывки после реакции усиления серебром. На данном этапе процедуры весь свет в темной комнате должен быть выключен, а красный свет — включен.

Однако исключительно для целей съемки свет останется включенным. В данной демонстрации из инкубатора, настроенного на 24 °C, извлеките растворы A и B из набора для усиления серебра; в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл добавьте шесть капель раствора A, затем шесть капель раствора B и тщательно перемешайте стеклянной пастерной пипеткой, избегая образования пузырьков. Перемешайте раствор на вортексе.

Кратковременно верните растворы A и B в инкубатор при 24 °C и достаньте раствор C. Добавьте шесть капель раствора C в смесь AB. Снова перемешайте с помощью пастеровской пипетки, после чего подвергните воздействию вортекса, избегая образования пузырьков.

Используйте полученную смесь немедленно. С помощью чистых антимагнитных пинцетов нанесите капли на парафильм. Поместите сетки в смесь.

Это реакция усиления серебром. Оставьте сетки на период от 6 до 15 минут, в зависимости от требуемой степени усиления для данного эксперимента. Извлеките сетки из смеси и быстро промойте их, пронося через последовательность из шести капель дважды дистиллированной воды, нанесенных на Perfil; при этом последние три промывки должны проводиться при температуре 24 °C.

Оставьте сетки на семь минут на каждую каплю воды. При проведении реального эксперимента включите свет после завершения промывки. Затем результаты визуализируют с помощью иммунозолотого мечения или окрашивания мембраны для исследования методом ЭМ.

Различные типы эндосомальных компартментов дрожжей можно метить нанозолотом с серебряным усилением и визуализировать с помощью электронной микроскопии. Пятиминутное поглощение нанозолота позволяет метить плазматическую мембрану и ранние эндосомальные компартменты, такие как одиночные везикулы, которые, вероятно, являются эндоцитозными везикулами, и тубулярные структуры, которые с большой вероятностью представляют собой ранние эндосомы. 30-минутная инкубация с нанозолотом приводит к мечению поздних эндосом или мультивезикулярных телец.

Разрешающая способность сочетания метода иммуноэлектронной микроскопии с данным протоколом усиления наночастицами золота и серебра подчеркивается сохранностью и качеством морфологии представленных органелл, в частности, внутренних везикул многовезикулярных телец. Перед применением метода усиления серебром необходимо провести предварительный эксперимент для определения оптимального времени инкубации, необходимого для обеспечения надлежащего размера и однородности этих частиц серебра. Далее следует данная процедура.

Для ответа на такие вопросы, как локализация конкретного белка в определенном субклеточном компартменте, могут быть использованы другие методы, например, иммуномаркировка.