Нанозолото Маркировка из дрожжей эндосомных системы для Ультраструктурные Анализы

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации на ультраструктурном уровне эндосомальных компартментов дрожжей Saccharomyces cei. Это достигается путем получения дрожжей Sphera plast, которые затем подвергаются эндоцитарному поглощению положительно заряженных наночастиц золота. На втором этапе образец фиксируется и разрезается для получения ультратонких криосекций клеток.

Затем криосекции подвергаются реакции усиления серебра. Для увеличения и визуализации положительно заряженных наночастиц нанозолота эндоцитозы получены результаты, которые показывают морфологию различных эндосомальных компартментов дрожжей на основе специфического мечения этой процедуры. Основным преимуществом этой методики из существующих нами методов, таких как мечение среза ImmunoGold, является то, что она не опирается на антитела, которые часто не работают при электромикроскопической подготовке.

Хотя этот метод может дать нам представление о лизосомальной системе дрожжей sarchi ESIS vei, он также может быть применен к другим эукариотическим моделям, таким как другие дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Дрожжи, из которых будет изготовлен Sphero Plast, сначала инкубируются в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия в 10 миллилитрах соответствующей среды, как определено планом эксперимента на следующий день. После измерения оптической плотности культуры на 600 нанометрах разбавьте клетки в той же питательной среде до наружного диаметра 600 от 0,2 до 0,4.

Вырастите клетки до фазы экспоненциального роста с наружным диаметром 600 от одного до двух переносов, 10 эквивалентов D 600 клеток в пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при 2100 G в течение пяти минут. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах 100 миллимолярных труб и 10 миллимолярных дихи трех в Холле инкубируйте при 30 градусах Цельсия в течение 10 минут. Соберите клетки методом центрифугирования.

После отбрасывания надосадочной жидкости суспендируйте клетки в пяти миллилитрах среды, содержащей один моляр сорбита, и пять миллиграммов литического фермента. Инкубируйте смесь при температуре 30 градусов Цельсия с легким встряхиванием в течение 30 минут. Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 300 G в течение пяти минут, чтобы собрать гранулированную фракцию, которая соответствует платам Сферо.

Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте брызги в 960 микролитрах ледяной среды, содержащей один моляр сорбита. Переложите смесь в ледяную двухмиллилитровую микроцентрифугу. Чтобы начать процедуру поглощения нанозолота, используйте пипетку и аккуратно смешайте пласт Sphero с четырьмя положительно заряженными частицами нанозолота.

Ресус суспензируют в 40 микролитрах воды. Конечный объем смеси должен составлять один миллилитр. Полученную клеточную суспензию поместите на лед на 15 минут.

Перенесите суспензию до комнатной температуры и инкубируйте в течение необходимого времени, чтобы обеспечить интернализацию нанозолота путем эндоцитоза. Когда желаемое поглощение нанозолота будет завершено, остановите реакцию, добавив в клеточную суспензию один миллилитр фиксатора двойной силы, содержащего один молярный сорбит. Держите трубку при комнатной температуре в течение 30 минут.

Осторожно переверните трубку микроцентрифуги вручную несколько раз в течение 30 минут, чтобы сохранить пласт и суспензию PHE Затем дважды переверните пробирку микроцентрифуги при давлении 1700 G в течение 25 секунд, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте один миллилитр свежего фиксатора стандартной силы, содержащего один моляр сорбита, инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре на медленно вращающемся колесе. Затем клетки обрабатываются и крио секционируются, как описано в текстовом протоколе перед началом этой процедуры, извлекают набор для усиления серебра из морозильной камеры и размораживают в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Поместите набор для размораживания в настольный инкубатор с температурой 24 градуса Цельсия, предварительно помещенный в темную комнату, до использования.

Поместите нагревательную плиту в темное помещение и прогрейте ее до конечной температуры 24 градуса по Цельсию. Накройте верхнюю часть нагревательной пластины скамейкой защитной поверхностью, защитите блестящей стороной вверх и закрепите ее скотчем. Поместите парапленку на защитную пленку и отметьте края черным маркером, чтобы обеспечить визуализацию в темноте.

Прикрепите термометр к верхней части защитного кожуха. Чтобы следить за температурой нагревательной пластины, постепенно регулируйте температуру. Если это не 24 градуса по Цельсию, поместите 50-миллилитровую трубку, содержащую двойную дистиллированную воду.

Внутри инкубатора наполните небольшую чашку Петри водой двойной дистилляции, предварительно предупрежденной при температуре 37 градусов по Цельсию. Поместите две никелевые сетки с криосекциями в воду образцом вниз на 30 минут. Через 30 минут наполните вторую чашку Петри предварительно теплой водой двойной дистилляции и опустите в воду те же две никелевые решетки еще на 30 минут.

Еще раз промойте решетки, пропустив их образцом вниз по нескольким каплям двойной дистиллированной воды при температуре 24 градуса Цельсия, помещенной на парфюм, который был закреплен на нагревательной пластине. Убедитесь, что девять дополнительных капель воды двойной дистилляции готовы на отваре для полоскания после реакции усиления серебра. На этом этапе процедуры необходимо выключить весь свет в темной комнате и включить красный свет.

Тем не менее, только в целях съемки свет будет оставаться включенным. В этой демонстрации извлеките растворы А и В из набора для усиления серебра из инкубатора при температуре 24 градуса Цельсия в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра с шестью каплями раствора А, а затем шесть капель раствора В и хорошо перемешайте стеклянной пипеткой для пасти, избегая образования пузырьков. Вихревой раствор.

Кратковременно верните растворы А и В в инкубатор с температурой 24 градуса Цельсия и выньте раствор С. Добавьте в смесь АВ шесть капель раствора С. Еще раз перемешайте с помощью пастообразной пипетки с последующим вортексированием, избегая образования пузырьков.

Используйте эту окончательную смесь немедленно. Нанесите капли на параформу с помощью чистого антимагнитного пинцета. Выложите сетки на смесь.

Это реакция усиления серебра. Оставьте сетки на шесть-15 минут в зависимости от желаемого улучшения для эксперимента. Выньте решетки из смеси и быстро пропустите их через последовательность из шести капель двойной дистиллированной воды, помещенной на Perfil при температуре 24 градуса Цельсия на последние три промывки.

Оставьте решетки на семь минут на каждую каплю воды. Если вы проводите настоящий эксперимент, снова включите свет, когда стирка будет завершена. Впоследствии результаты визуализируются либо с помощью мечения ImmunoGold, либо с помощью окрашивания мембраны для исследования ЭМ

Различные типы эндосомальных компартментов дрожжей могут быть помечены нанозолотом, усиленным серебром, и визуализированы с помощью электронной микроскопии. Пятиминутное поглощение нанозолота помечает плазматическую мембрану и ранние эндосомальные компартменты, такие как одиночные везикулы, которые, возможно, являются эндоцитарными везикулами и трубчатыми структурами, которые, скорее всего, являются ранними эндосомами. 30-минутная инкубация с нано-золотом приводит к мечению поздних эндосом или мультивезикулярных телец.

Разрешающая способность комбинации процедуры иммуноэлектронной микроскопии с этим протоколом усиления нанозолота и серебра подчеркивается сохранением и качеством морфологии показанных органелл, в частности, внутренних везикул мультивезикулярных тел. Прежде чем использовать метод усиления серебра, необходимо провести пилотный эксперимент, чтобы определить оптимальное время инкубации, необходимое как для размера, так и для однородности этих серебряных частиц. Следуя этой процедуре.

Другие методы, такие как иммунометка, могут быть выполнены, чтобы ответить на такой вопрос, как локализация определенного белка до специфического под марочным компартментом.