Бусы агрегации Анализы для характеристики Предполагаемые клеточной адгезии молекул

Общей целью данной процедуры является проверка способности эктодоменов белка опосредуть гомофильную адгезию для достижения этой плазмиды, кодирующие слияние фрагмента эктодомена с FC-областью IgG человека, трансфицируются в клетки HEC 2 93. Секретируемые гибридные белки Odin FC захватываются на магнитных шариках, конъюгированных с белком G, и после промывки покрытые гранулы вступают во взаимодействие в растворе. Затем покрытые гранулы визуализируются для оценки степени агрегации и, наконец, количественно оцениваются Используя простой анализ изображений, полученные данные показывают, способен ли исследуемый белок опосредовать гомофильную адгезию.

Основные преимущества этого метода перед существующими методами, такими как анализ агрегации клеток, заключаются в том, что он быстро, просто и напрямую проверяет адгезивную активность выбранного вами белка. Демонстрировать эту технику будет доктор Мишель Эман, старший научный сотрудник лаборатории. Начните эту процедуру с подготовки культивируемых клеток к NCA здесь ECFC за два-три дня до трансфекции.

Используйте 0,05%trips в ЭДТА для отделения клеток HEC 2 93 от культуральных чашек. Приготовьте по две 100-миллиметровые посуды для каждого состояния. Разделите клетки от одной до пяти, а затем культивируйте их.

Дополняют питательную среду. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, пока они не станут слитыми на 60-80%. В день трансфекции используйте реагент, такой как липосакция, для введения плазмиды, кодирующей слияние FC.

После трансфекции вернуть клетки в инкубатор на 24 часа на следующий день после трансфекции Предварительно прогреть, DMEM с пятым стрептококком и без фетальной бычьей сыворотки до 37 градусов Цельсия. Ополосните каждую посуду два раза 10 миллилитрами подогретой среды, а затем верните посуду в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение одного часа после инкубации, ополосните чашки для культур еще один раз 10 миллилитрами DMEM без фетальной бычьей сыворотки в общей сложности три промывки, затем инкубируйте перерезанные клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще 48 часов до сбора среды. Через четыре дня после трансфекции с помощью серологической пипетки соберите среду из каждой пары культуральных чашек и перенесите ее в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем центрифугируйте среду со скоростью 500 G в течение пяти минут, чтобы гранулировать клеточный мусор после отжима, наливайте среду из каждой 50-миллилитровой конической пробирки в 30-миллилитровый шприц и фильтруйте ее через шприц 0,45 микрона. Фильтруем в центробежный концентратор. Вращайте центробежные фильтры до тех пор, пока объем концентрированной питательной среды не уменьшится примерно до 500 микролитров.

Это занимает примерно 15 минут. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока вся питательная среда не будет добавлена и концентрирована. Далее в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра для каждого образца по 1,5 микролитра магнитных шариков белка G на один миллилитр ледяного связывающего буфера.

Самым сложным аспектом этой процедуры является агрегация швов. Чтобы обеспечить успех, обязательно точно следуйте процедуре. Следите за бусинами быстро, но не слишком строго.

Ни в коем случае нельзя позволять им высыхать на боковой стороне трубки или оставаться на магните слишком долго. Поместите трубку на магнит и с помощью пипетки аспирируйте буфер. Затем сразу же добавляют концентрированную питательную среду к белку G магнитных шариков.

Вращайте трубки на четыре градуса Цельсия в течение двух часов. Поместите трубки на магнит и быстро удалите среду. Дважды промойте бусины одним миллилитром ледяного связующего буфера, а затем повторно суспендируйте бусины в 300 микролитрах связующего буфера.

Разделите ресуспензионные бусины на две пробирки по 150 микролитров в каждую. Затем добавьте 1,5 микролитра хлорида кальция или ЭДТА для содержания кальция и отсутствия кальция соответственно. Переведите по 100 микролитров из каждого состояния в депрессию.

Хорошо проведите горку с помощью микроскопа с проходящим светом. Собирайте изображения из пяти полей зрения для каждого эксперимента в каждый желаемый момент времени. Использование image J или аналогичного программного обеспечения для анализа изображений.

Откройте в раскрывающемся меню один из пяти наборов данных изображений на изображении J. В верхней части экрана выберите «Файл». Затем выберите импорт, а затем последовательность изображений.

Найдите папку, содержащую файлы изображений, затем откройте их как стопку изображений. Далее в выпадающей строке меню нажмите на изображение, затем выберите свойства. Чтобы открыть там окно свойств.

Измените единицы измерения изображения на пиксели и установите ширину и высоту в пикселях на 1.0. Нажмите на изображение еще раз, выберите «Настроить», затем «Порог», чтобы открыть окно порога, и используйте ползунок для настройки порога изображения. Включите пиксели, которые вносят свой вклад в бусины, и исключите мелкие частицы.

Примените пороговое значение ко всем изображениям в стеке изображений. Далее в выпадающей строке меню в верхней части экрана. Нажмите на «Анализировать».

Затем выберите «Установить измерения», чтобы открыть диалоговое окно измерения с помощью флажков «Выбрать область» и «Положение стопки» в верхней части экрана. Нажмите «Анализировать», затем выберите «Анализировать частицы». Это позволит создать список идентифицированных частиц, включая их размер и изображение, на котором они были идентифицированы.

Повторяйте этот процесс для каждого эксперимента и для каждого экспериментального условия, чтобы определить кальций-зависимую адгезивную способность рыбок данио и кадгерина. Клетки HEC 2 9 3 были трансфицированы с доменом NCAT, геррин OD, слиты два fc, а последующие клетки агрегации кальций-зависимых гранул были визуализированы и проанализированы, как описано в этом видео, как можно увидеть на этих изображениях. В отсутствие кальция гранулы проявляют незначительную тенденцию к агрегации или вообще не имеют ее, и в присутствии кальция не наблюдается увеличения размера агрегата с течением времени.

Тем не менее, биты, покрытые NCAT, и ECFC демонстрируют устойчивую агрегацию с увеличением размера агрегата с течением времени в качестве полуколичественной меры адгезии. Изображения проходящего света из трех экспериментов были проанализированы для определения среднего размера агрегатов. Как видно на этом графике, агрегация гранул с покрытием ncoer ECFC в присутствии кальция и в его отсутствии определялась с интервалом в 15 минут.

В течение часа эти данные показывают, что эктодомен рыбки данио рерио n кадгерина опосредует кальций-зависимую гомофильную адгезию. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проверить, является ли адгезия неотъемлемым биохимическим свойством интересующего вас белка.