Почечная ишемия реперфузии: Мышь Модель травмы и регенерация

Описанная здесь мышиная модель реперфузионного повреждения при ишемии почек состоит из правой нефрэктомии, которая обеспечивает контрольную ткань, и зажима ножки левой почки, чтобы вызвать ишемию, которая приводит к острому повреждению почек. В этой модели используется лапаротомия по средней линии, при этом все этапы выполняются через один разрез.

В этой статье мы опишем мышиную модель острого повреждения почек, вызванного ишемическим реперфузионным повреждением, и подчеркнем, как она может быть очень полезной моделью как врожденного повреждения почки, так и регенерации почки. На этой схематической карикатуре изображены большие почечные кровеносные сосуды вместе с почками и мочеточниками. После срединной лапаротомии правый мочеточник перевязывается и выполняется правая нефрэктомия.

Левая почечная артерия и вена пережимаются травматическим зажимом, а через некоторое время зажим снимается и перфузия почек восстанавливается. Вот изображение типичного эксперимента. Правая ткань для нефрэктомии служит полезной контролируемой тканью.

Обычно их приносят в жертву в 24-часовой временной точке для изучения острого повреждения почек. Функцию почек можно оценить с помощью креатинина плазмы или азота мочевины крови. Ткань может быть оценена как на предмет травмы, как при остром тубулярном некрозе, так и на предмет регенерации, которая более заметна в более поздние сроки.

Очень важной особенностью данной модели является то, что ее можно использовать у мышей разного возраста, разных штаммов, а также как у самцов, так и у самок мышей. Здесь мы видим самца восьминедельной мыши Old B, которому была введена внутрибрюшинная инъекция кетамина, гидрохлорида и мейна. Операционная область была выбрита, а затем продезинфицирована с использованием разбавленного раствора хлоргексидина.

После этого мышь помещается на стерильную драпированную хирургическую подушечку с подогревом в положении лежа на спине, при этом верхние и нижние конечности фиксируются к коврику с помощью низкой клейкой ленты. На этом этапе наносится глазная мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы, и вводятся анальгетики путем подкожной инъекции бупренорфина гидрохлорида. Процедуры, проводимые с использованием стерильных автоклавных хирургических инструментов, находятся в пределах легкой досягаемости.

В стерильном хирургическом поле оператор будет одет в стерильный халат, маску и перчатки, а если проводится серия операций, то каждая процедура должна выполняться стерильными автоклавными инструментами с использованием ножниц, разделяющих ткани. Проводится лапаротомия по средней линии. Кожа тупо отделяется от брюшины, чтобы обеспечить легкость кожи и закрытие брюшины.

Позже после этого делается разрез вдоль линейной белой кости с помощью ножниц или скальпеля. В разрез вставляется ретрактор Collibra, и мышь покрывается стерильными простынями. Кишечник был смещен вправо и покрыт влагой и кровью, чтобы обнажить правую почку и мочеточник.

Как показано здесь, первым этапом правой нефрэктомии является выделение и разделение правого мочеточника. Правый мочеточник изолируют с помощью угловых щипцов и дважды перевязывают с помощью шва из шести шелковых плетеных нитей перед разделением. Как показано в этом клипе, соединительная ткань вдоль тыльной стороны правой почки тупо рассекается вплоть до почечной артерии и вены.

Как только почечная артерия и вена становятся доступными, щипцы осторожно скользят вниз, чтобы создать канал, который позволит наложить гемостатический зажим. Здесь вы можете видеть, как накладывается кровоостанавливающий зажим, и это предотвратит кровотечение из разрезанных почечных сосудов. После процедуры нефрэктомии окклюзированная почечная артерия и вена разделяются рядом с почкой, которая затем удаляется.

Незначительная потеря крови из почек очевидна, и она удаляется с помощью стерилизованных ватных палочек. Соединенные ткани спереди и сзади от левой почечной артерии и вены тщательно рассекаются. Канал под левыми почечными сосудами создается таким же образом, как описан при правой нефрэктомии.

Затем ишемия почек индуцируется путем наложения микроцеллофанового зажима для окклюзии как почечной артерии, так и вены. Успешное поступление ишемии может быть визуально подтверждено по постепенному равномерному потемнению почки. После индукции ишемии ретрактор удаляется, а брюшина закрывается одним швом.

Затем мышь немедленно помещается на гомеотемическое одеяло с ректальным TER, прикрепленным к блоку управления, чтобы обеспечить поддержание температуры тела на уровне 37 градусов в течение необходимой продолжительности ишемии. После периода ишемии микроклипса подвергается воздействию и удаляется сразу после удаления клипсы, почка быстро переходит от темно-фиолетового к здоровому розовому цвету, что свидетельствует об успешной реперфузии после тщательной замены кишечника. Брюшина зашивается с помощью шести плетеных шелковых швов.

Затем кожа закрывается с помощью металлических зажимов и йода, наносимого на операционную область, чтобы свести к минимуму риск послеоперационной инфекции. Анестезия частично отменяется подкожным введением аамаза. Все гидрохлориды и жидкости вводились путем подкожной инъекции одного миля теплого стерильного физиологического раствора.

Затем за мышами тщательно наблюдают до тех пор, пока они не придут в сознание, не станут бдительными и не смогут писать о себе, а также могут давать пищу, чтобы стимулировать потребление жидкости. Мышам позволяют восстановиться в отапливаемой камере, содержащейся при температуре 29 градусов по Цельсию, в тихой обстановке в течение 24 часов для длительных экспериментов. Проводится продолжающаяся анальгезия и через семь дней после операции удаляются зажимы для кожи.

Далее идут данные, указывающие на функциональное и структурное повреждение, произошедшее при биопсии. Мышей приносили в жертву через 24 часа после ишемии почек. Функция почек обычно оценивается путем измерения уровня креатинина в плазме или сыворотке крови или азота мочевины крови.

Графики свидетельствуют об увеличении почечной недостаточности с увеличением продолжительности ишемии. Структура почек исследуется с помощью гистопатологии на залитых палином срезах ткани, окрашенных либо H и E, либо PAS. Была принята простая бинарная система для оценки острого тубулярного некроза или TN во внешней полосе наружного мозгового вещества почки на основе клетки.

Морфология и клеточная целостность труб обозначаются как жизнеспособные со здоровой клеткой, монослойные или некротические, если клетки нарушены или потеряны. Количество некротических труб выражается в процентах от общего количества труб на поле. Как показывают графические данные, ишемия почек вызывает значительный острый некроз труб в ишемизированных почках по сравнению с контрольной группой без повреждений.

Следующие данные иллюстрируют регенерацию, которая происходит в течение семи дней после ишемии почек у восьми-10-недельных самцов мышей FVB. Функция почек постепенно восстанавливается в течение семи дней после ишемии, как креатинин плазмы, так и азот мочевины крови неуклонно снижаются, а креатинин плазмы возвращается к базальному уровню, что иллюстрирует улучшение функции почек для оценки структурной регенерации тканей после ишемического повреждения. Вкратце принята другая система оценки: на основе целостности клеток и номера клеток трубки обозначаются как здоровые, выздоравливающие, травмированные или некротические.

Затем они выражаются в процентах от общего числа труб. Система подсчета баллов подробно изложена в сопроводительном протоколе. Как показывают эти данные.

Повреждение тканей начинает проявлять признаки восстановления через семь дней после ишемии почек с увеличенным количеством труб, обозначенных как здоровые канальцевые клетки, пролиферация клеток является важным показателем регенерации. Мышам можно вводить BRDU перед жертвоприношением, а также включать и экспрессировать BRDU путем количественного определения и оценки с помощью иммуногистохимии на срезах почек, встроенных в патин. Изображения и графические данные показывают резкую пролиферацию канальцевых клеток и сопутствующее включение BRDU на четвертый день после ишемии, которое заметно уменьшается к седьмому дню.

Представленная здесь мышиная модель повреждения сращения почечной ишемии использует лапаротомию по средней линии, позволяющую проводить как правую нефрэктомию, так и зажимание ножки левой почки через один разрез. В качестве модели острого повреждения почек высокий уровень контроля над тяжестью повреждения обеспечивается путем титрования длины ишемии. Это очень универсальная модель, применимая для широкого спектра исследований молекулярных и клеточных медиаторов острого повреждения почек и последующей регенерации тканей.

Кроме того, наша лаборатория успешно использовала эту модель на широком спектре линий мышей обоих полов и разных возрастов.