Анализ трубчатой ​​мембраны сетей в кардиомиоциты от предсердий и желудочков

Общей целью этой процедуры является анализ сети трубчатых мембран в миоцитах предсердий и желудочков. Это достигается путем выделения предсердных и желудочковых миоцитов из сердца взрослой мыши. На втором этапе поперечная система аксиальных канальцев или татс окрашивается в неповрежденные живые изолированные сердечные миоциты.

Затем мембранная сеть татса визуализируется с помощью конфокальной или стационарной флуоресцентной микроскопии, а затем составляющие сети количественно анализируются. В конечном счете, различия между мембранными сетями разных типов клеток или между фиктивными и лечебными группами могут быть выявлены с помощью количественного анализа изображений татс. Основное преимущество этого метода выделения и анализа клеток заключается в том, что комплексный рабочий процесс выделения приводит к прямой флуоресцентной визуализации миоцитов, что позволяет проводить количественный анализ данных сети сенсорных мембран

Этот метод может дать представление об организации сложных мембранных сетей в живых здоровых кардиомиоцитах, но он также может быть применен к миоцитам больных или трансгенных животных. Новички в этом протоколе получат пользу от дополнительного вводного обучения для достижения последовательного выделения высококачественных сердечных миоцитов и важного предварительного условия для выполнения метода: Чтобы изолировать миоциты, начните с перфузии сердца мыши в возрасте 12 недель или старше с кислородным перфузионным буфером с температурой 37 градусов Цельсия в течение четырех минут, как только станет возможным извлечение органа. Затем изучите сердце с помощью буфера для пищеварения с температурой 37 градусов Цельсия в течение восьми-10 минут, наблюдая за ходом переваривания тканей для увеличения непрозрачности, мягкости и кислотности по всей видимой поверхности сердца.

После пищеварения отклоните правый придаток предсердия и рассеките правое предсердие чуть выше предсердных желудочковых клапанов. Продолжайте диссекцию левым предсердием, а затем рассеките и отбросьте фиброзный клапанный аппарат. Завершите диссекцию, освободив левую и правую свободные стенки желудочков, а также перегородку и более мелкие части тканей по мере необходимости.

Затем перенесите всю ткань желудочка в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 2,5 миллилитров буфера для пищеварения, а затем разрежьте ткань примерно на один миллиметр кубиками. Медленно съешьте кусочки ткани с помощью переводной пипетки, чтобы аккуратно диссоциировать миоциты желудочков в одноклеточную суспензию, стараясь избежать образования пузырьков или повреждения струей жидкости. Затем добавьте в клеточную суспензию 7,5 миллилитров стоп-буфера.

Параллельно разрежьте переваренную ткань предсердий примерно на один миллиметр кубиками в одном миллилитре пищеварения, буферизуйте в чашке Петри диаметром 60 миллиметров, а затем осторожно тритируйте миоциты предсердий, как показано только что. После механического перемешивания добавьте четыре миллилитра стоп-буфера, чтобы остановить остаточную активность коллагеназы в суспензии миоцитов предсердий. Затем перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и дайте оставшимся кусочкам ткани осадиться в течение 15 секунд перед сбором выделенных миоцитов с супинатной фракцией.

После одного этапа промывки осторожно суспендируйте миоциты предсердий в пяти миллилитрах перфузионного буфера и разделите клеточную суспензию на микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилира примерно в 10 раз по 10 к трем аликвотам клеток, чтобы окрашивать мембраны желудочковых миоцитов. Сначала дайте клеткам отстояться под действием силы тяжести в течение восьми минут и отправьте 1,5-миллилитровую реакционную пробирку для окрашивания в миоциты предсердий, откажитесь от клеток на две минуты при температуре, умноженной на 20 °G при комнатной температуре для любого типа клеток. Затем осторожно удалите супинат, стараясь избежать ненужного перемешивания клеточной гранулы.

Затем осторожно ресуспендируйте клетки в 800 микролитрах мембранного специфического красителя и ЭПС немедленно перенесите миоциты на покрытые ламинином покровные листы в камеру визуализации после 15-минутной инкубации в темноте. Крышка соскользнет один раз, а затем накройте их одним миллилитром перфузионного буфера. Возьмите образец изображения центрального внутриклеточного участка миоцитов, а затем используйте функцию обрезки для настройки окна обрезки и конечного размера пикселя до 100 на 100 нанометров.

Чтобы выбрать конечную плоскость изображения, используйте отдельные кадры изображения, чтобы вручную выбрать наиболее подходящую плоскость изображения в направлении Z. Убедитесь, что мембранная сеть TAs включает в себя как t-трубный, так и трубный компоненты и визуально видна в фокальной плоскости. Обратите внимание, что типичная внутриклеточная плоскость визуализации может включать ядро в качестве центральной внутриклеточной точки отсчета.

Чтобы проанализировать мембранную сеть tats и ее компоненты, теперь откройте файл изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений. Используйте инструмент выделения полигонов для обозначения области интереса, исключив мембрану внешней поверхности и включив внутриклеточные части мембранной сети тата, как показано на этом рисунке. Затем с помощью команд edit и clear outside сгенерируйте выбранный ROI таким образом, чтобы выбранная внутриклеточная область содержала только внутриклеточные мембранные участки сети tats, но не какие-либо участки поверхностной мембраны.

Теперь нажмите на «Процесс» и вычтите фон и установите радиус катящегося шара на пять пикселей. Затем выберите процесс и усильте локальный контраст. И установите размер блока равным 49, бины гистограммы равны 256, максимальный наклон равен трем и маске равен нулю.

Нажмите «Процесс» и «Сгладить» в разделе «Плагины», выберите сегментацию и статистическое объединение регионов и установите параметр в значение Q 100. Затем нажмите на «Показать средние значения». Затем выберите тип изображения и восемь бит, а затем выберите настройку изображения и порог, начиная с порога 40.

Обратите внимание, что правильный выбор порога должен выдавать только специфические таты мембранных структур, а не ложноположительные сигналы из-за фонового шума. Затем в разделе «Плагины» выберите скелет и скелетированное 2D 3D и сохраните скелетированное 2D-изображение в качестве адаптационного файла. Теперь снова выберите плагины и проанализируйте скелет 2D 3D, чтобы проанализировать файл скелетированного изображения для вывода количественных данных.

Затем выберите none для метода цикла обрезки и подтвердите автоматическое создание результирующей таблицы данных. Теперь используйте направленность плагина Fiji для анализа индивидуальных ориентаций соответствующих компонентов налоговой сети на основе скелетированных данных изображения. В разделе method выберите компоненты FURIER, концевые ячейки 180 и начало гистограммы минус 45 градусов.

Наконец, проверьте таблицу отображения и сгенерируйте гистограмму направленности. На этом первом рисунке показано репрезентативное скелетированное изображение татуаторов в миоците здорового желудочка, состоящем из поперечных элементов, перпендикулярных оси X изображения, и осевых компонентов, расположенных параллельно оси X. Применение плагина направленности приводит к построению гистограммы ориентации желудочков с сопоставимыми пиками при нулевых градусах. представляющий осевую пропорцию и под углом 90 градусов представляющий поперечную. В отличие от этого, репрезентативное скелетированное изображение татов в миоците предсердий в основном состоит из осевых компонентов, параллельных оси X изображения.

Таким образом, соответствующая гистограмма ориентации демонстрирует доминирующий пик вокруг нулевого градуса, представляющий аксиальную пропорцию татов, и только небольшой пик под углом 90 градусов, представляющий поперечную пропорцию татов. При попытке выполнения этой процедуры важно проверять качество клеток на каждом этапе после выделения клеток, во время визуализации, и, что наиболее важно, непосредственно перед анализом изображения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как сложные мембранные структуры, сети tes и потенциально мембраноассоциированные белки полностью дифференцируются. Взрослые сердечные миоциты могут быть визуализированы с помощью конфокальной микроскопии и количественно проанализированы.

Пожалуйста, не забывайте, что работа с липофильной мембраной глаз, ферментами пищеварения и потенциально инфекционным сердечным заболеванием может быть опасной, и что при выполнении этих процедур всегда следует принимать меры предосторожности, такие как защита кожи железом.